CRISPR/Cas最新研究進展（2020年12月快報）

即將過去的12月份，有哪些重大的CRISPR/Cas研究或發現呢？小編梳理了一下這個月報導的CRISPR/Cas研究方面的新聞，供大家閱讀。

1.開發出CiBER-seq新技術，可同時分析細胞中的多達100個基因
doi:10.1126/science.abb9662

CRISPR-Cas9可以很容易地敲除或調整單個基因，以確定其對有機體或細胞，甚至另一個基因的影響。但是，如果你能一次進行幾千個實驗，利用CRISPR逐個對基因組中的每一個基因進行調整，並快速看到每一個基因的影響呢，那會怎麼樣呢？

在一項新的研究中，來自美國加州大學伯克利分校的研究人員開發出一種簡單的方法來做到這一點，它讓任何人都可以對細胞（包括人類細胞）進行分析，並迅速確定基因組中所有調控特定基因表達的DNA序列。相關研究結果發表在2020年12月11日的Science期刊上，論文標題為“CiBER-seq dissects genetic networks by quantitative CRISPRi profiling of expression phenotypes”。

CiBER-seq原理示意圖，圖片來自Science, 2020, doi:10.1126/science.abb9662。

這種新技術，被稱為CiBER-seq（CRISPR interference with barcoded expression reporter sequencing），通過讓數萬個CRISPR實驗合併在一起，同時完成這些實驗。該技術摒棄了熒光，採用深度測序的方式，直接測量合併樣本（pooled sample）中基因活性的增加或減少。深度測序採用高通量、長讀的新一代測序技術，對合並樣本中表達的所有基因進行測序和基本計數。

2.Nucleic Acids Res：發現兩種較小的新型Cas9核酸酶，有望更容易地進行基因組編輯
doi:10.1093/nar/gkaa998

在一項新的研究中，來自俄羅斯科學院、俄羅斯國家研究中心分子遺傳學研究所和斯科爾科沃科學技術研究院等研究機構的研究人員描述了兩種新的緊湊的Cas9核酸酶，即CRISPR-Cas系統具有切割活性的組分，這將有可能擴大Cas9工具箱在基因組編輯中的應用。這兩種Cas9核酸酶中的一種被證實可以在人類細胞中發揮作用，因而可用於生物醫學應用。相關研究結果發表在2020年12月2日的Nucleic Acids Research期刊上，論文標題為“PpCas9 from Pasteurella pneumotropica — a compact Type II-C Cas9 ortholog active in human cells”。論文通訊作者為俄羅斯國家研究中心分子遺傳學研究所的Konstantin Severinov博士。

他們描述了兩種新的小型Cas9核酸酶：一種來自Defluviimonas sp.20V17（一種生活在熱液噴口的細菌），即DfCas9，另一種來自侵肺巴斯德菌（Pasteurella pneumotropica，一種在齧齒動物和其他哺乳動物中發現的常見細菌），即PpCas9。這兩種核酸酶恰好對AAV載體來說足夠小，並且具有相對較短的PAM，對於Cas9核酸酶來說，這是“兩全其美”的選擇。

這兩種新的Cas9核酸酶與II-C型CRISPR-Cas系統有關，與SpCas9相比，通常表現為更小的Cas9效應物。這兩種核酸酶採用了類似於其他Cas9蛋白的保守的雙葉結構，但也有獨特的特點：它們缺乏幾個插入子結構域，並且有一個較小的Wedge結構域（負責與單向導RNA支架相互作用的結構域，因而更加緊湊。 

3.Science子刊：利用智慧手機超靈敏定量檢測唾液中的新冠病毒
doi:10.1126/sciadv.abe3703

根據一項新的研究，一種基於唾液的行動式智慧手機平臺為COVID-19測試提供了一種超靈敏但易於使用的方法，它可以在15分鐘內給出測試結果，而無需進行當前金標準所需的資源密集型實驗室測試。該方法在12名COVID-19感染者和6名健康對照者中進行了測試。相關研究結果於2020年12月11日線上發表在Science Advances期刊上，論文標題為“A smartphone-read ultrasensitive and quantitative saliva test for COVID-19”。論文通訊作者為美國杜蘭大學醫學院的Tony Y. Hu博士。

Hu及其同事們證實，這種技術將熒光顯微鏡讀出裝置與智慧手機配對，從CRISPR/Cas12a檢測中確定病毒載量，與成熟的定量逆轉錄酶聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）方法一樣有效。

這些作者寫道，“我們相信，未來類似的智慧手機平臺有可能迅速擴大COVID-19篩查能力，並有可能簡化接觸者追蹤的驗證，以改善當地的疫情遏制，併為區域疾病控制工作提供資訊。”

4.Nature子刊：抗CRISPR蛋白介導的CRISPR-Cas9系統可提高基因編輯效率，同時降低脫靶效應
doi:10.1038/s42003-020-01340-2

CRISPR-Cas9基因編輯可能會引起不想要的遺傳變化。在一項新的研究中，來自日本廣島大學和東京醫科齒科大學的研究人員開發出一種很有前途的修復方法，即關閉CRISPR-Cas9基因編輯，直到它達到關鍵的細胞週期階段，在這個階段，更精確的修復可能會發生。根據這些研究結果，他們成功地展示了更精確的基因編輯，並抑制了稱為脫靶效應的非預期基因缺失、插入或突變。相關研究結果近期發表在Communications Biology期刊上，論文標題為“A cell cycle-dependent CRISPR-Cas9 activation system based on an anti-CRISPR protein shows improved genome editing accuracy”。

雖然之前開發的方法報告了較少的與CRISPR技術相關的脫靶效應，但是這些研究人員表示，這些方法往往表現出較低的編輯效率。論文通訊作者、廣島大學生物醫學與健康科學研究生院教授Wataru Nomura說，“我們的目標是開發出避免脫靶效應的方法，脫靶效應是基因組編輯領域最具挑戰性的問題之一。我們的方法是一箭雙鵰。我們可以同時提高基因組編輯的精確性和抑制脫靶效應。”

5.重磅Cell論文詳解！利用CRISPR-Cas13a和智慧手機攝像頭在30分鐘內定量檢測新冠病毒RNA
doi:10.1016/j.cell.2020.12.001

在一項新的研究中，這些研究人員概述了一種基於CRISPR的COVID-19測試技術，該技術使用智慧手機攝像頭，可在30分鐘內提供準確結果。相關研究結果於2020年12月4日線上發表在Cell期刊上，論文標題為“Amplification-free detection of SARS-CoV-2 with CRISPR-Cas13a and mobile phone microscopy”。

圖片來自Cell, 2020, doi:10.1016/j.cell.2020.12.001。

在這種新的測試方法中，Cas13a蛋白與一種在切割時會產生熒光的報告分子結合在一起，然後與來自鼻腔拭子的患者樣本混合。混合後的樣本被放置在一種連線到智慧手機的裝置中。如果樣本中含有SARS-CoV-2 RNA，Cas13就會被啟用，並切割報告分子，導致熒光訊號產生。然後，基本上變成了顯微鏡的智慧手機攝像頭可以檢測到熒光，並報告測試的拭子呈病毒陽性。 

論文共同通訊作者、格拉斯通病毒學研究所主任Melanie Ott博士說，“對於科學界來說，不僅要增加測試，而且要提供新的測試選擇，這一直是一項緊迫的任務。我們開發的測試方法可以提供快速、低成本的檢測，幫助控制COVID-19的傳播。”

6.Nat Commun：利用AAV9-CRISPR-Cas9基因編輯有望清除受感染細胞DNA中的HIV DNA
doi:10.1038/s41467-020-19821-7

猿猴免疫缺損病毒（SIV）是一種與人類免疫缺陷病毒（HIV）存在密切親緣關係的病毒。在一項新的研究中，來自美國天普大學劉易斯-卡茨醫學院和杜蘭大學等研究機構的研究人員在HIV研究方面邁出了重要一步：他們成功地從非人靈長類動物的基因組中剔除了SIV。這一突破使得他們比以往任何時候都更接近開發治癒人類HIV感染的方法。相關研究結果近期發表在Nature Communications期刊上，論文標題為“CRISPR based editing of SIV proviral DNA in ART treated non-human primates”。 

論文共同通訊作者、天普大學劉易斯-卡茨醫學院綜合神經愛滋病中心主任Kamel Khalili博士說，“我們首次發現，單次注射我們的由腺相關病毒（AAV）攜帶的CRISPR基因編輯構建體，可以從恆河猴的受感染細胞中剔除SIV基因組。”

7.Nat Commun：新型CRISPR-Cas9變體可提高基因編輯的安全性和有效性
doi:10.1038/s41467-020-19842-2

在一項新的研究中，來自美國密歇根大學醫學院的研究人員發現，使用一種新的修復DNA的CRISPR-Cas9變體將會改善備受吹捧的CRISPR-Cas9工具的安全性和有效性。相關研究結果近期發表在Nature Communications期刊上，論文標題為“MiCas9 increases large size gene knock-in rates and reduces undesirable on-target and off-target indel edits”。

論文共同通訊作者、密歇根大學醫學院心血管中心內科、心臟外科、生理學、藥理學和藥物化學教授Y. Eugene Chen博士解釋說，這兩個關鍵問題---安全性和有效性---是繼續阻礙CRISPR-Cas9基因編輯發揮其全部臨床潛力的原因。另外兩名論文共同通訊作者為密歇根大學醫學院的Jifeng Zhang和Jie Xu。

這種新的CRISPR-Cas9變體提高了將基因或DNA片段插入到基因組的精確位置時的效率，即所謂的敲入（knocking in）。它還降低了基因編輯時經常發生的鹼基對的意外插入或缺失（insertions or deletions, indels）率。

8.bioRxiv：通過編輯人類神經細胞中的關鍵基因或有望改變其患阿爾茲海默病的風險
doi:10.1101/2020.10.27.357830

近日，一篇發表在預印版平臺bioRxiv上的研究報告中，來自拉瓦爾大學等機構的科學家們通過研究表示，通過編輯神經細胞中的關鍵基因或能增加個體患阿爾茲海默病的風險，文章中研究人員描述瞭如何對相關基因進行編輯以及其所產生的影響效應。

此前研究結果表明，參與阿爾茲海默病發生的其中一個風險因素就是腦細胞中β-澱粉樣蛋白的積累，而且某些人群機體中攜帶有名為A673T的基因突變，相比一般人群而言，表達該基因突變的人群患阿爾茲海默病的風險要比前者低4倍，這項研究中，研究人員通過研究編輯人類腦細胞使得個體機體攜帶基因突變A673T，同時他們發現這或許會降低個體患阿爾茲海默病的風險。

研究者指出，A673T突變不同於不表達單一DNA元件的個體機體中所攜帶的同源性基因，這就表明，通過新增突變或許更加容易一些，隨後研究者嘗試利用CRISPR技術來對腦細胞進行編輯，雖然這一嘗試相對成功一些，但研究人員還嘗試了使用prime編輯技術（prime editing），這種相對較新的技術能允許研究者將一個鹼基字母轉換成另外一個鹼基字母，利用該技術，研究者就能夠在體外對大約40%的腦細胞進行編輯，這似乎並不足以防止β-澱粉樣蛋白的積累，也不足以減緩阿爾茲海默病的進展；後期還需要研究人員進行更多研究得出更多的結果。

9.Cell子刊解讀！開發出新型CRISPR標記技術或能提高利用幹細胞培養出模式細胞的準確性！
doi:10.1016/j.celrep.2020.108460

日前，一篇刊登在國際雜誌Cell Reports上題為“Master Regulators and Cofactors of Human Neuronal Cell Fate Specification Identified by CRISPR Gene Activation Screens”的研究報告中，來自杜克大學等機構的科學家們通過掌握基因調節網路的“語言”開發了一種新方法能將幹細胞轉化成為想要的細胞型別。將幹細胞轉化成為其它型別的細胞並不是一個新的想法，目前已經存在多種方法，但其所得到的結果仍然有一些值得改進的地方；通常情況下，當在實驗室培養過程中，程式化的幹細胞並不能正確成熟，因此研究人員就需要尋找用於實驗的成體神經細胞來最終得到胚胎神經元，而胚胎神經元無法模擬遲發性的精神疾病和神經退行性疾病。

研究者Josh Black說道，這些細胞乍一看可能是對的，但他們往往缺少一種你所想要的關鍵細胞屬性，利用CRISPR基因編輯技術，我們就能開發出新方法來識別出哪些轉錄因子（基因火星的主要控制器）能幫助製造好的神經元。這項研究中研究者開發出了能夠製造成熟成體神經元的新方法，目前該方法能用於程式設計任何型別的細胞。CRISPR技術通常用於編輯DNA序列，也就是大家俗稱的基因編輯，其中Cas9蛋白能與導向RNA結合並指導其切割特定位點的DNA，進而導致DNA序列的改變，DNA編輯如何已經被廣泛用於改變基因的序列，但在基因被關閉的情況下其似乎並不能發揮作用。 

一種失活的Cas9蛋白（dCas9）能附著在不能切割的DNA位點上。實際上，如果沒有另一種分子連線或招募到它，其就不會發揮任何作用；此前研究人員報導了多種方法將不同的分子結構域吸附到dCas9蛋白上，從而來告訴細胞開啟基因或重塑染色質的結構；研究人員非常感興趣利用開啟基因表達的特殊工具將一種細胞型別轉化為能創造出更好的疾病模型的另一種細胞型別。

10.CRISPR-Cas9技術編輯的CAR-T細胞或能增強機體抵禦血液癌症的潛力
新聞來源：CRISPR-edited CAR T cells enhance fight against blood cancers

近日，在2020年第62屆美國血液學會年會(ASH)上，來自賓夕法尼亞大學的科學家們展示了他們最新的臨床前研究結果，他們發現，利用CRISPR/Cas9技術敲除CAR-T細胞上能抑制T細胞啟用的特殊蛋白或能增強工程化T細胞清除血液癌症的能力。研究人員敲除了CAR-T細胞上名為CD5的基因，隨後將其輸注回攜帶T細胞和B細胞白血病/淋巴瘤的小鼠體內，CD5基因能編碼T細胞表面的CD5蛋白，而且還會抑制其啟用。相比輸注了非編輯CAR-T細胞的小鼠而言，輸注了CD5被剔除的CAR-T細胞的小鼠機體外周血中的T細胞增殖水平較高，而且腫瘤尺寸發生了明顯下降，且小鼠有更好的生存結局。

CRISPR技術能幫助科學家們鎖定並編輯任何不需要的基因，以癌症為例，該技術就能通過剔除T細胞中的特殊基因來幫其更好地抵禦腫瘤，這種方法與CAR-T細胞療法密切相關，即研究人員通過收集患者機體自身的T細胞，對其進行工程化修飾表達新型受體從而尋找並攻擊癌細胞。醫學博士Marco Ruella說道，我們通過研究首次表明，我們可以成功利用CRISPR/Cas9技術來敲除CAR-T細胞表面的CD5，從而增強其攻擊癌症的能力，在多種癌症模型中，編輯和非編輯CAR-T細胞之間的差異非常驚人。

研究人員首次在T細胞白血病模型中檢測了這種新方法，抗CD5的CAR-T細胞能被遺傳工程化修飾來尋找惡性T細胞上的CD5並對其發起攻擊；由於CD5在正常T細胞中也會表達，隨後研究人員從CAR-T細胞對CD5進行了移除，這樣就能避免對其它CAR-T細胞的殺滅效應，從而就能潛在釋放CAR-T細胞的啟用，否則就會被這些細胞上CD5的存在所抑制。

實際上，在體內和體外實驗中，CD5被剔除的抗CD5 CAR-T細胞要比CD5沒有被剔除的CAR-T細胞的效力更強，而且有超過50%的小鼠在長期的實驗中得到了治癒。為了檢測CD5的剔除是否會增加靶向作用抗原而不是CD5的CAR-T細胞的抗腫瘤效應，隨後研究人員在CTL019 CAR-T細胞對抗CD19+ B細胞白血病的環境下進行了證實，值得注意的是，同樣在該模型中，CD5的敲除會明顯增強CTL019 CAR-T細胞的抗腫瘤效率，同時還會讓大部分小鼠的疾病完全緩解期延長。

11.EMBO J：如何建立小鼠模型用於疫苗研究
doi:10.15252/embj.2020105926

為了開發疫苗並研究人類的免疫應答，科學家們依賴於多種動物模型，包括可以通過基因工程B細胞受體產生人類抗體的小鼠，該B細胞受體是與B細胞膜結合的專門抗體。但是，這些小鼠通常需要數年的時間才能發育，需要複雜的基因修飾和仔細的繁殖過程。MGH，麻省理工學院和哈佛大學Ragon研究所副所長Facundo Batista博士說：“產生這些專門小鼠的時間一直是延遲疫苗開發的主要因素。隨著CRISPR / Cas9等基因編輯技術的最新發展，我們知道必須有一種方法可以大大加快這一過程。”

Batista小組開發了一種新的方法來生成用於臨床前疫苗評估的小鼠品系，從而大大縮短了這一時間表。在最近發表在《 EMBO》雜誌上的一項研究中，這種採用CRISPR / Cas9技術的一步法可以在短短几周內產生具有基因工程人B細胞受體的小鼠。

圖片來源：Www.pixabay.com。

為了測試這項技術，研究人員對小鼠進行了改造，使其具有人類B細胞受體，而人類B細胞受體是所謂的廣泛中和HIV抗體的前體。已知這些抗體可有效對抗HIV，但很難通過疫苗接種來刺激。前體通過產生廣泛中和的抗體樣突變對目前在臨床HIV試驗中使用的抗原產生反應。快速評估不同抗原啟用這些前體的能力的能力具有顯著加速疫苗開發的潛力。

12.NEJM兩項臨床試驗結果表明：新型基因療法或有望治療鐮狀細胞性貧血症
doi:10.1056/NEJMoa2029392; doi:10.1056/NEJMoa2031054

近日，兩篇發表在國際雜誌New England Journal of Medicine上的研究報告中，來自美國、德國、加拿大和法國的科學家們通過研究開發出了能靶向治療鐮狀細胞性貧血(sickle-cell anemia)的新型基因療法。在第一篇研究報告中，研究人員利用CRISPR-Cas9基因編輯系統增強了鐮狀細胞性貧血症患者機體中胎血紅蛋白(fetal hemoglobin)的產生。在第二篇研究報告中，研究人員試圖尋找能促進鐮狀細胞性貧血症患者機體胎血紅蛋白產生的方法，他們使用了一種不同的技術，該技術主要能通過病毒載體引入RNA，從而改變胎血紅蛋白基因的表達。 

研究者表示，這兩種新型療法選擇均為臨床試驗的一部分，其旨在改變主要誘發鐮狀細胞性貧血的致病基因；在這兩種情況下，臨床醫生都會移除一部分患者機體的血液幹細胞，並試圖使得患者機體的遺傳開關發生失活，隨後給與患者化療手段來破壞其機體中發生錯誤的細胞，這種新改變的幹細胞就能被重新輸注到患者體內。隨著時間推移，進入患者機體的幹細胞就會生長成為正常的血液細胞並讓患者擺脫疾病的折磨。

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