Qiime1-12.菌群組成分析

weixin_33670713發表於2018-12-07

本節就要進入更為關鍵的分析流程了——菌群組成的分析。進行16S測序的目的就是為了研究不同樣本間的菌群組成差異，本節我們將講解如何用qiime1繪製菌群丰度分佈圖、菌群差異分析以及繪製菌群丰度熱圖。

繪製菌群丰度分佈圖

菌群分類統計圖能夠展示每個組或者每個樣本的菌群比例。在qiime1中用於生成該影象的命令是summarize_taxa_through_plots.py，該命令具體包括3個指令：

  1. collapse_samples.py and/or sort_otu_table.py (http://qiime.org/scripts/collapse_samples.html/ http://qiime.org/scripts/sort_otu_table.py)

  2. summarize_taxa.py (http://qiime.org/scripts/summarize_taxa.html)

  3. plot_taxa_summary.py.py(http://biocore.github.io/emperor/build/html/scripts/plot_taxa_summary.py.html)
    其中第一步collapse_samples.py and/or sort_otu_table.py是一個非必需步驟，主要取決於你是否需要對樣本進行選擇性的展示，如果你只想展示某一部分樣本，或者想要合併某一組的樣本可以使用該命令。

# Plot group average  繪製每組平均值
summarize_taxa_through_plots.py \
-i otu_table.biom \
-o taxa_summary_plots \
-m mapping_file.txt \
-c SampleType

# Plot each sample 繪製每個樣本
summarize_taxa_through_plots.py \
-i otu_table.biom \
-o taxa_summary_plots \
-m mapping_file.txt

最後會產生一個資料夾。其中有一個網頁.html會展示所有的圖片結果，你也可以在資料夾中找到原始的圖片。

丰度差異的檢驗

通過繪製菌群丰度分佈圖後，你大致瞭解了樣本中丰度較高的菌群主要有哪些。那麼接下來，你肯定會好奇在你的實驗組和對照組中究竟有哪些OTU存在顯著差異。Qiime1提供了檢測差異的命令，當然你也可以使用其他非常流行的方法比如LEfSe。之後我們會對如何使用LEfSe進行講解，本節我們先講解如何使用Qiime1自帶的命令進行檢驗比較。
Qiime推薦了兩種方法，第一種是geroup_significance.py

group_significance.py \
-i otu_table.biom \
-o kruskal_wallis_test.txt \
-m mapping_file.txt \
-c SampleType \
-s kruskal_wallis

其中-s方法可以選擇下述檢驗方法：nonparametric_t_test, bootstrap_mann_whitney_u, ANOVA, kruskal_wallis, g_test, parametric_t_test, mann_whitney_u

另外一種是利用DESeq2進行更加深入的差異檢驗（做過RNA-seq分析的人一定對這個名字DESeq2不陌生）。具體如下：

differential_abundance.py 
-i otu_table.biom 
-o diff_otus.txt 
-m mapping_file.txt 
-a metagenomeSeq_fitZIG 
-c Treatment 
-x Control 
-y Fast

其中-c是告訴程式需要比較哪一項，比如在此處我們想要比較不同Treatment的差異，其中Treatment有兩組Control和Fast，所以告訴程式-x是Control組，-y是Fast組。

想要知道這兩個命令更為詳細的資訊可以檢視：
group_significance.py：
http://qiime.org/scripts/group_significance.html
differential_abundance.py：
http://qiime.org/scripts/differential_abundance.html

樣本丰度歸一化

除了使用相對丰度對樣本進行歸一化，Qiime1還提供了DESeq2和CSS這些歸一化方法。經過歸一化的樣本更加適合進行fitZIG和DESeq2的差異檢驗。

normalize_table.py \
-i otu_table.biom \
-o otu_table_deseq2_normalized.biom \
-a DESeq2

繪製丰度熱圖

熱圖是一種直觀的展示各個樣本不同菌群丰度的形式。Qiime1也可以直接製作熱圖。

make_otu_heatmap.py \
-i otu_table.biom \
-o heatmap_sorted.pdf \
-m mapping_file.txt \
-t rep_set.tre

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