說說核磁樣品如何製備的問題！

樣品的溫度、觀測核的頻率和樣品中自旋核的數目都會影響檢測訊號的強度。將樣品的濃度儘可能最大化並降低樣品的溫度方面來改進檢測靈敏度的方式不是在任何情況之下都可行的。增加溶質的量和降低溶液溫度會增加溶液粘度，從而降低譜圖的解析度，因此粘度引起的譜峰增寬實際上降低了訊雜比。

配製高質量的樣品溶液是得到理想核磁資料的前提條件。下面介紹配置高質量樣品的一些基本原則。

1核磁樣品管的選擇

儘可能選擇經濟承受範圍以內的最高質量核磁樣品管。樣品管的直徑與核磁核磁探頭的線圈直徑相匹配。除非沒有其他的選擇，不要把5mm的樣品管放在10mm的探頭裡面。在任何情況下，絕對不能使用比探頭線圈直徑大的樣品管。對於大多數的有機樣品，wilmad 527-pp-7(國外報價10美元以內)或者同等質量的樣品管就能夠滿足需要。價格便宜的樣品管管壁厚度不一，這種不均勻性使得樣品在勻場過程中很難甚至不可能達到很好的狀態。同軸性、曲面、橫截面的不均勻性都限制了資料的質量。想辦法在核磁管上節約成本的人應當瞭解一下公式（1），其中t為時間，$為花費，通過公式計算，我們可以選擇在核磁管上多花費$10或者花一個小時時間來勻場還可能得不到分辨很好的圖譜。另外，核磁管可以多次使用，高質量核磁管的額外花費在多年的使用過程很容易就會回報回來。

2樣品的純度

樣品純度越高越好。核磁實驗希望樣品有高的溶解度，但是樣品的純度高更好。如5mM高純度產物比20mM摻雜有其他異構體或者中間反應產物更好。為了採集到的13C訊號更強，可以在做樣品提純之前先測試一維的碳譜。根據氫碳－HMQC/HSQC和HMBC圖譜結果能幫助區分出混合物中1D譜圖裡的假峰。在機時緊張的情況下，很難保障提純後的樣品能夠得到訊雜比足夠高的13C譜。也就是說，提純後低濃度的樣品花24個小時採集的一維碳譜有可能在我們希望能夠觀測到季碳化學位移的範圍內只看到噪聲。掃描4天后雖然能夠加倍訊雜比，但是在多使用者使用的條件下也是不可行的。因此如果我們只有少量的產品，可以通過二維技術，避免重複合成、分離、提純和樣品的準備，在不用掃描一維13C譜的情況下，還是能夠完全的指認我們分子的1H和13C譜峰。

3氘代溶劑的選擇

使用高質量的氘代試劑。儘可能使用一次性的0.5到0.6毫升的小瓶試劑，而不是用容量為50或者100g的大包裝試劑。氘代氯仿儲存時間超過6個月會降解產生酸性，因此會交換溶質分子中的不穩定氫。如果溶質分子包含有低的pKa的氫原子或者被酸催化會被降解時，必須要特別注意這一點。

4核磁管的清洗（大家亦可檢視上期“15個NMR常見問題”中核磁管清洗經典操作）

當使用樣品管的時候，即使是新樣品管，也要進行徹底的清洗。如果清洗核磁管不當，會檢測到核磁管殘留的溶劑訊號。一般情況下把樣品管浸泡在鍾酒精浴中30秒能夠解決此問題。注意，當進行此步驟的時候，需要帶上手套、實驗服或者圍裙、安全口罩或者面罩。

有時候，使用正確的方式清洗核磁管也會不可避免的引起物理磨損。在這種情況下，我們就要輕輕的擦洗核磁管的內壁和外壁。可以用管刷來清潔5mm樣品管，但是必須非常小心以免管刷尾部暴露的金屬刮壞核磁管的內壁。

另外也可以使用核磁樣品管清洗器，這種裝置可以在Wilmad核磁管代理和青島騰龍微波公司處買到。如果可能，使用色譜或者光譜純度水或者丙酮用於最後的沖洗。最好的沖洗最好不要使用DMSO，除非接下來需要重新使用DMSO溶解樣品。這是因為DMSO蒸氣壓力低而造成其揮發慢。注意：在使用DMSO時一定要戴手套。如果DMSO溶液接觸到我們的皮膚，DMSO就會將溶質透過皮膚直接匯入到我們的體內血液迴圈中去。

5核磁管的乾燥

烘乾價格昂貴的核磁管時，儘量把核磁管平放在廚房用紙或者乾淨的織物上面。不要把核磁核磁管豎直放在容器或者燒瓶中存放，不要把樣品管放在乾燥箱中超過一分鐘。價格昂貴的核磁核磁管同心性和弧度非常高，壁厚和玻璃組成成分非常均勻。管壁越厚，玻璃管在平面上滾動越快。如果將核磁管直立在乾燥箱的容器內，地心引力會將核磁管彎曲，改變本來的弧度。如果將核磁管平放太長時間，它們也會形成一段橢圓形的部分，因而同心性會變差。而薄的管壁比較容易破損。

另外，核磁管可以用核磁管檢測器來檢查同心性和弧度。核磁管檢測器可以從Wilmad或者其他廠商買到。

6樣品混合

如果樣品有限，並已經樣品溶解到溶劑中，必須確認溶液完全混合。但是，在混合樣品時必須很小心，因為標準高密度聚乙烯材質的核磁核磁管帽子可被常用的氘代核磁溶劑溶解（至少染色劑會被溶解）。用振盪器可以實現有效混合，但是也有例外。核磁核磁經驗豐富的人經常用一隻手輕輕的握住核磁管，用手指拍打來加速混合和溶解（對薄壁核磁管一定要特別小心，例如wilmad 535-pp或者更高質量）。有時可用細長巴斯德吸液管重複吸走再引入來加速混合。重水樣品在混合過程中容易產生氣泡，因此必須小心不要太用力的混合。

7樣品的體積

配製溶液的體積會影響到勻場速度。在5mm直徑的核磁核磁管裡，體積為0.6-0.7ml的溶液最適宜的。

每一臺核磁核磁譜儀都配有一個高度量筒來準確標定核磁管相對於探頭檢測線圈的位置。如圖1所示，當轉子-樣品管裝好並放進磁體之後核磁核磁管的樣品將處於探頭的檢測器區域，（檢測器在電阻器-電感線圈-電容器迴路中的電感線圈）。在把核磁管放進轉子之前，需要小心翼翼的擦拭核磁管（指紋會有訊號並妨礙平穩轉動）。利用高度量筒將核磁管在轉子裡定位，一旦樣品管-轉子在空氣的幫助下放入磁體內，溶液的上表面（溶液凹面）和下表面（管子底部）到檢測區域的中心是等距的。

千萬不要讓樣品管超出轉子中樣品深度的最大值，這樣將導致樣品管放入的時候損壞核磁管或探頭上的玻璃保護套。如果樣品管的溶液過高，不能把溶液的中心對準檢測區域的中心。此時，把轉子中的樣品管推到最低深度，此時凹面到檢測中心的距離長於核磁管底部到檢測中心的距離。

8樣品濃度

理想情況下，我們嘗試使用一個樣品濃度的平衡。如果我們的樣品太稀，採集一個簡單的一維譜圖可能會花掉幾個小時的時間。如果樣品太濃，訊號峰會因高濃度引起的粘度過高，分子轉動速度變慢而增寬。分子轉動速度慢只會部分平均偶極和化學位移張量，不能實現各個方向的平均。只有各個取向的平均才能觀測到窄的共振峰。

a、溶質過量的情況
當樣品充裕的時候，配製溶液應當確保均勻。首先必須避免固體存在於核磁管中，一個例外情況是乾的分子篩（或者乾燥劑）在核磁樣品管的底部，遠離檢測區域。如果想要配製飽和溶液又不擔心粘度高引起核磁核磁譜峰增寬，可加入過量溶質充分混合之後再過濾。

沒有過濾的溶液也可以進行核磁檢測，但是這種實驗的結果一般不是很理想，因為這會丟失掉很多有用的細節資訊，同時會引起核磁譜峰增寬。固體和液體的磁化率（讓磁場線透過材料的能力）有很大差別，因此儘量避免能夠引起譜線增寬的因素。溶液的不均一性將導致磁場不均勻，這種不均勻性很難通過勻場線圈進行有效的補償。新手描述溶液中的固體存在方式為漂浮（在溶液頂部的固體）或者沉澱（在溶液底部的樣品）或者懸浮（在溶液中部的固體）。在這三種情況中，懸浮引起的問題更多，因為這些固體會不斷的進出檢測區域。每個沒有溶解的溶質顆粒通過檢測區域時都會有磁場均勻性的畸變。

溶液在放入核磁樣品管之前首先要過濾固體顆粒。當使用傳統核磁樣品管的時候，樣品的溫度必須一直保持在溶劑的沸點以下，尤其是當使用腐蝕性的溶劑如三氟醚乙醇（TFE）和三氟乙酸（TFA）時更要如此。因為加熱樣品會給核磁樣品管造成額外的壓力，樣品管的帽子可能會崩開，樣品管內的溶液會噴出濺到磁體上部的腔體上，然後滴落到核磁探頭內，因而對儀器造成很大的損害。在核磁管帽周圍包裹聚氯乙烯絕緣帶可以防止樣品在加熱的過程中帽子被彈出，但是更可行的方法是使用特殊的核磁管，例如J.Young核磁管。

b、溶質有限的情況
當溶質量有限且溶解度很高時，可以嘗試減少溶液總體積來增加濃度。但是溶液體積太少會引起譜峰增寬，從而降低了訊雜比。這種譜峰變寬是由於檢測區域附近磁場的不均勻造成的，也就是，減少溶液的體積來增加濃度經常會利大於弊。

如果樣品的量雖然少，但是稀釋之後可以在儀器時間允許的情況下完成實驗，此時，我們可以藉助於使用磁化塞子，shigemi管，甚至特殊的探頭（價格昂貴的可用特殊核磁管），例如布魯克80微升樣品容量的微量探頭或者瓦里安40微升樣品容量的nano探頭。在400MHz或者500MHz 核磁譜儀上，廣西醫療器械檢測經驗證明掃描濃度低於2mM樣品的2D譜圖是有問題的。掃描濃度低於5mM樣品的一維碳譜也是有問題的。在200 MHz或者300MHz 核磁譜儀上，需要的樣品濃度大約是上述要求的兩倍。

9最優化的溶質濃度

一般而言，獲取優質核磁圖譜的樣品濃度在20-50mM範圍之間。溶液粘度引起的偶極作用或者化學位移各向異性引起的譜線增寬的臨界點會依據溶質的量、溶劑、溫度和核磁操作者判斷而改變。

樣品濃度對於核磁測試非常重要。假設濃度為20mM的樣品，花費30秒鐘時間採集氫譜（掃描4次），其中非耦合甲基峰的訊雜比為100:1。同一樣品濃度為1.4mM時，該甲基峰的訊雜比是多少呢？

訊號強度Si直接正比於掃描次數n和樣品的濃度Ci，但是噪聲部分被抵消，只有掃描次數的平方根。因而訊雜比的增長為掃描次數的二分之一次方。

如果20mM樣品取樣30秒的訊雜比為100:1，1.4mM樣品相同條件下訊雜比則為1.4/20×100:1或者7:1。

1.4mM樣品要得到20mM樣品（30秒）的訊雜比，必須增加兩個濃度比例平方的取樣時間，即使用核磁儀器時間（98分鐘）得到同樣的訊雜比。

10避免樣品的降解

在前面提到，使用一次性溶劑溶解樣品，儘可能阻止樣品發生化學反應包括不穩定的質子交換。使用有機溶劑的時候，儘可能保持樣品無水，如在5mm樣品管的底部放入分子篩，保持分子篩邊緣處於樣品的檢測區域以外。

儘可能減少樣品暴露在氧氣和水蒸氣中的時間，方便的話在手套箱中準備樣品。如果要保證核磁管內的樣品處在惰性的環境中，可以先使用乳膠膜取代聚乙烯帽子密封我們的樣品管，然後使用插管透過乳膠膜將溶液倒入到樣品管中。但是乳膠膜隨著時間變長可滲透氧氣和水蒸氣。把另一個保護套套在核磁樣品管帽子上也會降低水蒸氣和氧氣進入引起的降解。要意識到樣品管賣家在銷售時不會清洗樣品管。