這篇文章更多的是對於混亂的中文資源的梳理，並補充了一些沒有提到的重要引數，希望大家不會踩坑。

1. 簡介

1.1 背景

WGCNA（weighted gene co-expression network analysis，權重基因共表達網路分析）是一種分析多個樣本基因表達模式的分析方法，可將表達模式相似的基因進行聚類，並分析模組與特定性狀或表型之間的關聯關係，因此在基因組研究中被廣泛應用。

相比於只關注差異表達的基因，WGCNA利用數千或近萬個變化最大的基因或全部基因的資訊識別感興趣的基因集，並與表型進行顯著性關聯分析。既充分利用了資訊，也把數千個基因與表型的關聯轉換為數個基因集與表型的關聯，免去了多重假設檢驗校正的問題。

WGCNA演算法首先假定基因網路服從無尺度分佈(scale free network)，並定義基因共表達相關矩陣、基因網路形成的鄰接函式，然後計算不同節點的相異係數，並據此構建分層聚類樹(hierarchical clustering tree)，該聚類樹的不同分支代表不同的基因模組(module)，模組內基因共表達程度高，而分屬不同模組的基因共表達程度低。

1.2 無尺度網路

網路的數學名稱是圖，在圖論中對於每一個節點有一個重要概念，即：度(degree)。一個點的度是指圖中該點所關聯的邊數。如下圖，如果不加以思考，人們很容易認為生活中常見的網路會是一種random network，即每一個節點的度相對平均。然而第二種圖，即scale-free network才是一種更穩定的選擇。Scale-free network具有這樣的特點，即存在少數節點具有明顯高於一般點的度，這些點被稱為hub。由少數hub與其它節點關聯，最終構成整個網路。這樣的網路的節點度數與具有該度數的節點個數間服從power distribution。生物體選擇scale-free network而不是random network尤其進化上的原因，對於scale-free network，少數關鍵基因執行主要功能，這種網路具有非常好的魯棒性(Robust)，即只要保證hub的完整性，整個生命體的基本活動在一定刺激影響下將不會受到太大影響，而random network若受到外界刺激，其受到的傷害程度將直接與刺激強度成正比。

隨機網路，大部分節點都連出2到3條邊，0條與1條邊的和4條邊的都很少，而無尺度網路中，大部分節點連1條邊，少數節點（紅色）連有大量邊。

1.3 相關術語

• 共表達網路：點代表基因，邊代表基因表達相關性。加權是指對相關性值進行冥次運算 (冥次的值也就是軟閾值 (power, pickSoftThreshold這個函式所做的就是確定合適的power))。無向網路(unsigned network)的邊屬性計算方式為 abs(cor(genex, geney)) ^ power；有向網路(signed network)的邊屬性計算方式為 (1+cor(genex, geney)/2) ^ power; sign hybrid的邊屬性計算方式為cor(genex, geney)^power if cor>0 else 0， sign hybrid意味著它既包含加權網路也包含非加權網路。這種處理方式強化了強相關，弱化了弱相關或負相關，使得相關性數值更符合無標度網路特徵，更具有生物意義。除了軟閾值還有硬閾值一說，計算方式是 a_ij = 1 if s_ij > β otherwise a_ij = 0。這裡的β就是硬閾值(hard threshold)。

• Module(模組)：高度內連的基因集。在無向網路中，模組內是高度相關的基因。在有向網路中，模組內是高度正相關的基因。

• Connectivity (連線度)：類似於網路中 “度” (degree)的概念。每個基因的連線度是與其相連的基因的邊屬性之和。

• Module eigengene E: 給定模型的第一主成分，代表整個模型的基因表達譜。即用一個向量代替了一個矩陣，方便後期計算。

• Intramodular connectivity: 給定基因與給定模型內其他基因的關聯度，判斷基因所屬關係。

• Adjacency matrix (鄰接矩陣)：基因和基因之間的加權相關性值構成的矩陣。

• TOM (Topological overlap matrix)：把鄰接矩陣轉換為拓撲重疊矩陣，以降低噪音和假相關，獲得的新距離矩陣，這個資訊可拿來構建網路或繪製TOM圖。

2. 一般步驟

WGCNA一般步驟

3. 程式碼

利用WGCNA有一步法建網路的，也有step by step的方法，為了保證理解，建議至少過一遍step by step。

安裝WGCNA根據不同的作業系統可能略有不同，我在macOS下安裝著實廢了一番功夫。這一部分不提。

# 載入必須的包並做引數設定
library(MASS)
library(class)
library(cluster)
library(impute)
library(Hmisc)
library(WGCNA)
options(stringsAsFactors = F)

讀取基因表達資料，注意要做一個轉換，保證基因在列，樣品在行，官方推薦使用Deseq2的varianceStabilizingTransformation或log2(x+1)對標準化後的資料做個轉換。如果資料來自不同的批次，需要先移除批次效應。如果資料存在系統偏移，需要做下quantile normalization。一般要求樣本數多於15個。樣本數多於20時效果更好，樣本越多，結果越穩定。

dat0 <- read.csv("./01raw_data/GBM55and65and8000.csv")
datExprdataOne <- t(dat0[,15:69])
datExprdataTwo <- t(dat0[, 70:134])
datSummary <- dat0[, c(1:14)]
dim(datExprdataOne); dim(datExprdataTwo); dim(datSummary)
rm(dat0)
#[1]   55 8000
#[1]   65 8000
#[1] 8000   14

檢驗資料質量

gsg = goodSamplesGenes(datExprdataOne, verbose = 3)
if (!gsg$allOK){
  # Optionally, print the gene and sample names that were removed:
  if (sum(!gsg$goodGenes)>0) 
    printFlush(paste("Removing genes:", 
                     paste(names(datExprdataOne)[!gsg$goodGenes], collapse = ",")));
  if (sum(!gsg$goodSamples)>0) 
    printFlush(paste("Removing samples:", 
                     paste(rownames(datExprdataOne)[!gsg$goodSamples], collapse = ",")));
  # Remove the offending genes and samples from the data:
  datExprdataOne = datExprdataOne[gsg$goodSamples, gsg$goodGenes]
}
#Flagging genes and samples with too many missing values...
#  ..step 1

檢查是否有離群值，結果顯示無

sampleTree = hclust(dist(datExprdataOne), method = "average")
plot(sampleTree, main = "Sample clustering to detect outliers", sub="", xlab="")

離群值檢測

篩選軟閾值， 無向網路在power小於15或有向網路power小於30內，沒有一個power值可以使無標度網路圖譜結構R^2達到0.8或平均連線度降到100以下，則可能是由於部分樣品與其他樣品差別太大造成的。這可能由批次效應、樣品異質性或實驗條件對錶達影響太大等造成，需要移除。

powers1 <- c(seq(1, 10, by=1), seq(12, 20, by=2))
sft <- pickSoftThreshold(datExprdataOne, powerVector = powers1)
RpowerTable <- pickSoftThreshold(datExprdataOne, powerVector = powers1)[[2]]

cex1 = 0.7
par(mfrow = c(1,2))
plot(RpowerTable[,1], -sign(RpowerTable[,3])*RpowerTable[,2], xlab = "soft threshold (power)", ylab = "scale free topology model fit, signes R^2", type = "n")
text(RpowerTable[,1], -sign(RpowerTable[,3])*RpowerTable[,2], labels = powers1, cex = cex1, col = "red")
abline(h = 0.95, col = "red")
plot(RpowerTable[,1], RpowerTable[,5], xlab = "soft threshold (power)", ylab = "mean connectivity", type = "n")
text(RpowerTable[,1], RpowerTable[,5], labels = powers1, cex = cex1, col = "red")

軟閾值篩選

橫軸是Soft threshold (power)，縱軸是無標度網路的評估引數，數值越高，網路越符合無標度特徵 (non-scale)。
我們可以使用系統給的引數幫助我們得到soft threshold，可以是

sft$powerEstimate
#4

給出的是4，因為這個篩選的標準是R-square=0.85，但是我們希望R-square的值達到0.9，所以選擇power值為6.

利用power=6計算connectivity，並且視覺化無尺度網路圖的拓撲結構

betal = 6
k.dataOne <- softConnectivity(datExprdataOne, power = betal) -1
k.dataTwo <- softConnectivity(datExprdataTwo, power = betal) - 1
par(mfrow=c(2,2))
scaleFreePlot(k.dataOne, main = paste("data set I, power=", betal), truncated = F)
scaleFreePlot(k.dataTwo, main = paste("data set II, power=", betal), truncated = F)

Data I scale free plot

Data II scale free plot

篩選連通性最高的3600個基因做為後續分析，不過一般不在這一步進行篩選，因為生物體內的基因網路圖更多的是無尺度的。

kCut <- 3601
kRank <- rank(-k.dataOne)
vardataOne <- apply(datExprdataOne, 2, var)
vardataTwo <- apply(datExprdataTwo, 2, var)
restK <- kRank <= kCut & vardataOne >0 & vardataTwo > 0 
ADJdataOne <- adjacency(datExpr = datExprdataOne[,restK], power = betal)
dissTOMdataOne <- TOMdist(ADJdataOne)
hierTOMdataOne <- hclust(as.dist(dissTOMdataOne), method = "average")
par(mfrow = c(1,1))
plot(hierTOMdataOne, labels = F, main = "dendrogram, 3600 mast connected in data set I")

Data I的層級聚類圖

層級聚類樹展示各個模組, 灰色的為未分類到模組的基因，這裡使用的cutreeStaticColor檢測module，但是對於複雜的基因結構建議使用 cutreeDynamic。其中也有一些具體的引數可以選擇得到合適的module。

colordataOne <- cutreeStaticColor(hierTOMdataOne, cutHeight = 0.94, minSize = 125)
par(mfrow=c(2,1), mar = c(2,4,1,1))
plot(hierTOMdataOne, main = "Glioblastoma data set 1, n = 55", labels = F, xlab = "", sub = "")
plotColorUnderTree(hierTOMdataOne, colors = data.frame(module = colordataOne))
title("module membership data set I")

Data I層級聚類圖

後續換了一種方法希望得到更多module以期得到更多的eigegene。

dataOne_net = blockwiseModules(datExprdataOne, power = 6, maxBlockSize = 200,
                       TOMType = "signed", minModuleSize = 30,
                       reassignThreshold = 0, mergeCutHeight = 0.25,
                       numericLabels = TRUE, pamRespectsDendro = FALSE,
                       saveTOMs=TRUE, corType = "pearson", 
                       loadTOMs=TRUE,
                       saveTOMFileBase = "DataI.tom",
                       verbose = 3)

# Calculating module eigengenes block-wise from all genes
#  Flagging genes and samples with too many missing values...
#    ..step 1
# ....pre-clustering genes to determine blocks..
#   Projective K-means:
#   ..k-means clustering..
#   ..merging smaller clusters...
# Block sizes:

繪製模組之間相關性圖

dataOne_MEs <- dataOne_net$MEs

plotEigengeneNetworks(dataOne_MEs, "Eigengene adjacency heatmap", 
                      marDendro = c(3,3,2,4),
                      marHeatmap = c(3,4,2,2), plotDendrograms = T, 
                      xLabelsAngle = 90)

eigengene聚類及熱圖

視覺化基因網路 (TOM plot)

load(dataOne_net$TOMFiles[1], verbose=T)

## Loading objects:
##   TOM

TOM <- as.matrix(TOM)

dissTOM = 1-TOM
# Transform dissTOM with a power to make moderately strong 
# connections more visible in the heatmap
plotTOM = dissTOM^7
# Set diagonal to NA for a nicer plot
diag(plotTOM) = NA
# Call the plot function

TOMplot(plotTOM, dataOne_net$dendrograms, 
        main = "Network heatmap plot, all genes")

Data I的TOM plot

匯出網路圖

probes = colnames(dat0[,15:69])
dimnames(TOM) <- list(probes, probes)
# Export the network into edge and node list files Cytoscape can read
cyt = exportNetworkToCytoscape(TOM,
             edgeFile = "edges.txt",
             nodeFile = "nodes.txt",
             weighted = TRUE, threshold = 0,
             nodeNames = probes, nodeAttr = dataOne_net$colors)

部分參考：

http://blog.sciencenet.cn/blog-118204-1111379.html

https://www.jianshu.com/p/94b11358b3f3