眼睛是心靈的窗戶，而眼部疾病則為這扇窗戶蒙上一層陰影。在所有的眼部疾病中，角膜病應當是大家最為耳熟的詞彙之一。角膜病被列為全球第4大致盲疾病，全球約有2000多萬因角膜病致盲患者，其中我國約有400萬患者，且發病資料在逐年增加。

在角膜的解剖結構中，角膜上皮幹細胞（LESC）的存在保證了角膜上皮的快速穩定更新，而一旦這些細胞缺乏時，就會導致角膜緣幹細胞缺乏症（LSCD）。LSCD的常見症狀包括持續性的角膜上皮缺損、炎症和角膜疤痕，嚴重者可造成視力障礙甚至失明，極大影響了患者的生活質量。而傳統的眼角膜移植療法無法治療LSCD，新開發的自體或異體角膜緣移植物替代療法則具有較高的免疫排斥風險和誘發供體眼發生LSCD的風險。

為了解決上述問題，研究人員開發了體外擴增培養LSC後再進行移植的CLET療法並取得了一定的長期療效。但是由於其在生產過程中使用了鼠源的飼養層細胞和胎牛血清，容易產生額外的生物安全問題，因此在美國並不符合現行的cGMP，從而限制了其使用範圍。

針對CLET療法中存在的生物安全問題，來自美國哈佛大學醫學院丹娜法伯癌症研究院的研究人員在國際著名期刊Science Advances發表了題為《Cultivated autologous limbal epithelial cell (CALEC) transplantation: Development of manufacturing process and clinical evaluation of feasibility and safety》的研究性論文。

圖1 論文標題

在這項研究中，研究人員開發了新的方法在體外透過人羊膜來培養自體角膜上皮細胞（CALEC），避免了使用抗生素和小鼠飼養層細胞，並在5名患者上進行了一期臨床試驗，測試了其良好的治療效果。

圖2角膜緣上皮細胞的體外培養和典型表徵。

首先，研究人員採集了角膜緣樣品用於製備單細胞懸液，將其鋪於6孔板匯中後經過9.1±2.5天的培養形成P0單層細胞，隨後收集細胞將至接種到去上皮化的AmnioGraft上，經過6.7±1.4天培養後轉移至羊膜上進行培養形成P1細胞。培養過程中透過乳酸脫氫酶(LDH)檢測和顯微鏡來確定P1細胞的數量和形態。

同時，在P0細胞的培養過程中， 研究人員還使用流式細胞術檢測了P0細胞高表達（約95%）上皮標誌物CD49F 和 CD340，低表達白細胞/內皮標誌物CD45/CD31以及間充質幹細胞標記物CD13，這些標誌物表明P0細胞具有上皮細胞表型。進一步地，研究人員還使用集落形成效率(CFE) 評估了LSC的乾性。並透過檢測胞內iATP發現LSC的增殖存在劑量依賴性。最後，研究人員透過加入Edu染料和LIVE/DEAD法來檢測了P1細胞的增殖能力和活力，結果表明P1細胞具較高的活力和增殖能力（分別為83.0±1.0%和25.0±2.0%）。

圖3 CALEC 細胞中幹細胞標誌物的表達情況。

進一步地，研究人員又使用免疫熒光對p63、p63α、C/EBPδ和Krt12等標誌物進行了檢測，結果表明在P0至P1等不同階段都可以檢測到乾性標誌物的表達。定量分析顯示出p63的亮陽性率為5.5±1.9%，p63α的亮陽性率為5.4±1.1%，C/EBPδ的亮陽性率為1.2±0.4，Krt12的亮陽性率為2.3±1.0。

圖4最佳化儲存條件示意圖

為了保證一期臨床移植手術的順利實施，研究人員進一步探究了從實驗室到手術室的最佳儲存運輸條件。透過比較不同條件下的LDH水平和細胞死亡率，最終確定最佳儲存運輸條件為將細胞儲存於HypoThermosol FRS介質中並放置於EVO 裝置，溫度設定為2° 至 8°C，運輸過程中使用GPS 進行溫度和傾斜監控。

圖5  CALEC 一期臨床移植方案

在完成了前期臨床前開發過程後，研究人員在5名患者身上進行了 1 期臨床試驗，以檢測 CALEC 移植物用於單側 LSCD 的安全性和可行性和初步療效（IND #16102；NCT02592330）。在1期臨床測試中，供體眼睛均痊癒，沒有併發症，視力在 4 周內恢復到基線水平，並未發生重大安全事件。

圖6 患者接受 CALEC 移植物的特徵和生物標誌物分析。

在1期臨床試驗中，研究人員統計的CALEC 移植物總培養時間為 13.0 至 22.0 天。P0 培養物的平均存活率為 78.7 ± 4.2%。流式細胞術結果表明了P0期細胞培養結束時均表達上皮細胞表型。但是，在5名患者中，有2名患者治療失敗，其餘3名患者的CALEC 移植物免疫熒光分析顯示Krt12、p63、p63α和C/EBPδ的平均陽性率分別為2.9%、2.8%、4.3%和2.7%。

總的來說，使用自體和同種異體角膜緣上皮細胞來治療 LSCD 的技術早在幾十年前就已經有所報導，但是之前的技術都不符合美國的cGMP標準，因此本項研究就在原有基礎上創新性地開發了無異生素、無血清和無抗生素的培養方法並體外製備了CALEC。同時， 1期臨床試驗5名患者中的4名在接種12個月後獲得了穩定的眼表面功能，表明了該方法的有效性。未來，研究人員將在前述研究基礎上進行更加嚴格和長時間的療效和安全性評估，這項研究的成功也將極大推動幹細胞療法的發展。

參考文獻：

1. Ula V. Jurkunas et al. ,Cultivated autologous limbal epithelial cell (CALEC) transplantation: Development of manufacturing process and clinical evaluation of feasibility and safety.Sci. Adv.9,eadg 6470(2023). DOI:10.1126/sciadv.adg6470

來自： 生物谷