以CAR-T療法為代表的T細胞免疫療法，已經在一些惡性腫瘤的治療中展現出令人鼓舞的效果，但目前還難以獲得持久的療效，造成這個現象的原因包括T細胞耗竭、T細胞衰老、免疫抑制的腫瘤微環境等[1,2]。
對CAR-T細胞進行改造，使其克服這些困難，是目前研究的重點，而基因編輯技術為改造T細胞提供了一個絕佳的機會，體外CRISPR基因編輯技術不僅可以用於製造腫瘤特異性T細胞[3]，還能夠用來篩選調控T細胞功能的關鍵基因[4,5]。
近期，史丹佛大學醫學院Crystal L.Mackall教授領銜的研究團隊在頂級學術期刊《科學》上發表研究成果[6]，他們透過全基因組CRISPR敲除篩選發現，敲除中介體複合物上的激酶——MED12，能夠十分顯著地提升T細胞的抗腫瘤活性，並使其維持效應表型。
研究顯示，敲除MED12後中介體與染色質上增強子區域的結合，尤其是轉錄因子STAT和AP-1的區域結合增加，從而上調了T細胞上IL2RA的表達，使T細胞對IL-2的響應能力增強，提高了T細胞的抗腫瘤活性。
論文首頁截圖
為了篩選出抑制T細胞中增殖以及細胞因子分泌的基因，研究團隊在人源CAR-T細胞中進行全基因組CRISPR敲除篩選，分析敲除不同的基因後，T細胞的增殖以及細胞因子分泌能力強弱。在敲除中介體複合物中的激酶MED12以及細胞週期蛋白C（CCNC）後，T細胞的增殖以及細胞因子分泌能力均顯著增強。
敲除MED12或CCNC，可增強T細胞的增殖及細胞因子分泌能力
為了驗證上述CRISPR篩選的結果，研究團隊在CAR-T細胞中敲除了MED12或CCNC，檢測其增殖能力以及細胞因子分泌功能。長達23天的體外培養結果顯示，敲除了MED12或CCNC後，CAR-T細胞的增殖能力顯著增強，並且這種增強與CAR靶向的抗原以及CAR內部的共刺激結構域無關。
流式細胞術以及多重免疫分析結果顯示，在與腫瘤細胞共培養、並敲除MED12或CCNC後，CAR-T細胞分泌更高水平的促炎性細胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-17）、炎性趨化因子（CXCL10、CCL3）和促進T細胞存活以及分化的共同γ鏈細胞因子（IL-2、IL-9）。
敲除MED12和CCNC，可增強CAR-T細胞的增殖及細胞因子分泌功能
既然敲除MED12或CCNC後，CAR-T細胞的增殖以及細胞因子分泌能力均得到增強，那麼其抗腫瘤能力是否得到了提升呢？
為了探究這個問題，研究團隊給予荷瘤小鼠CAR-T細胞治療，結果顯示，敲除MED12或CCNC的CAR-T細胞更加有效地抑制了腫瘤的生長，並顯著延長了荷瘤小鼠的生存期。
敲除MED12或CCNC，增強了CAR-T細胞的抗腫瘤能力
抗腫瘤是一場持久戰，敲除MED12（它在兩個CRISPR篩選中均是效果最顯著的基因，因此後續只研究這一個基因）之後CAR-T細胞的持久作戰能力是否得到增強呢？
為了探究這個問題，研究團隊檢測了在體外長期培養並多次接受腫瘤細胞刺激的CAR-T細胞增殖、細胞因子分泌及殺傷能力。他們發現，敲除MED12後，CAR-T細胞能一直維持良好的增殖能力，即使經過多次腫瘤細胞共培養刺激（模擬長期慢性刺激）也一直保持旺盛的增殖能力，以及強大的殺傷功能和細胞因子分泌能力。
更進一步地，研究團隊在荷瘤小鼠中測試了CAR-T細胞長期對抗腫瘤的能力，他們給接受CAR-T細胞治療後倖存的小鼠再次接種腫瘤細胞，發現敲除MED12的CAR-T細胞可以再次清除腫瘤細胞，維持小鼠的存活。
這些資料表明，敲除MED12後能夠極大地增強CAR-T細胞的長期抗腫瘤活性，更加有效地保護機體。
敲除MED12的CAR-T細胞長久作戰能力得到顯著提升
為了探究敲除MED12增強T細胞抗腫瘤活性的機制，研究團隊使用ChIP-seq檢測敲除MED12後，CAR-T細胞內的中介體複合物與染色質的結合位點是否發生變化。結果顯示，敲除MED12之後，中介體複合物與染色質的結合顯著增加，並且結合增加的位點中包含了促進T細胞效應分化與存活的基因（包括TCF7、IFNG、IL2RA等）。
接下來，研究團隊結合ATAC-seq以及ChIP-seq等技術，尋找敲除MED12後CAR-T細胞中最關鍵的轉錄調控變化。結果顯示，敲除MED12後CAR-T細胞中STAT5的磷酸化水平顯著升高並伴隨其下游基因IL2RA表達的上調，這顯著增加了T細胞對IL-2的敏感度。
深入的分析表明，敲除MED12增加了STAT5結合基序處的染色質開放程度，並且增加了中介體複合物與STAT5的共定位，增加了IL2RA的表達，使T細胞對IL-2更加敏感，從而啟動一個前饋反應，增加STAT5的磷酸化水平，進一步維持了IL2RA的高表達與T細胞的抗腫瘤活性。
敲除MED12後，STAT5的磷酸化水平以及IL2RA的表達顯著上調
總的來說，這項研究成果表明，敲除中介體複合物中的激酶MED12能夠顯著增強T細胞的抗腫瘤能力，並揭示其內在機制為啟動IL2RA-STAT5-IL2RA正反饋迴圈，增強T細胞對IL-2的敏感性，維持其長期存活、增殖、細胞因子分泌以及細胞毒功能。
研究概括圖
對T細胞進行工程化改造以提高其清除致病細胞的能力是一項革命性的工作，CAR-T細胞已經在腫瘤免疫治療、抗衰老[7]、抗纖維化[8]等多個領域嶄露頭角。尋找限制T細胞增殖以及效應功能的因素，進一步對CAR-T細胞進行最佳化將會為人類的健康前景產生積極的影響。
這項研究成果提示，敲除CAR-T細胞中的MED12有望改善現有的CAR-T細胞治療效果，為更多患者帶來希望。
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