疼痛是腫瘤最常見的併發症之一。在接受治療的腫瘤患者中，超過1/3的患者會遭受疼痛折磨[1]。
有研究發現，疼痛會抑制免疫反應，促進腫瘤的生長[2]。不過，疼痛、腫瘤及免疫三者間的聯絡非常複雜[3]，還有很多謎團有待科學家解開。
近日，蒙特利爾大學Sebastien Talbot帶領的團隊，在《自然》雜誌上發表了傷害感受神經元促進腫瘤生長的相關研究[4]，讓我們對神經和抗腫瘤免疫有了新的認知。
他們發現，黑色素瘤細胞會啟用傷害感受神經元，誘導傷害感受神經元釋放神經肽CGRP，導致CD8+T細胞進入耗竭狀態，而阻斷這一通路可以破除腫瘤的免疫逃逸。
論文首頁截圖
血管生成對腫瘤進展的促進作用已廣為人知[5]。近年來，隨著神經科學相關技術的發展，人們逐漸認識到神經系統對腫瘤也有重要影響。
例如，交感腎上腺素能神經可啟用腫瘤中血管內皮細胞，從而促進腫瘤生成[6,7]。此外，交感神經也可抑制免疫系統，輔助腫瘤細胞逃逸[8]。除了外周自主神經，中樞神經系統中的神經祖細胞可誘導腫瘤內神經生成並驅動腫瘤生長[9]。
傷害感受神經元對腫瘤的神經支配是否影響腫瘤免疫，目前仍有待研究。
Sebastien等將表達GFP的B16F10黑色素瘤（其腫瘤細胞帶綠色熒游標記）接種在Nav1.8Cre::tdTomatofl/WT小鼠上（其傷害感受神經元帶紫色熒游標記）。
接種後的第21天，他們在黑色素腫瘤組織中發現大量的傷害感受神經元（圖1）。同時，他們在細胞實驗中也發現黑色素腫瘤細胞能促進神經元軸突生成。
圖1. 黑色素瘤中傷害感受神經元的分佈
為了探索黑色素腫瘤細胞與傷害感受神經元間更深層次的關係，Sebastien等系統地實施了一系列細胞實驗。
他們發現，單獨培養傷害感受神經元不會釋放神經肽，但將其與黑色素腫瘤細胞共培養後，傷害感受神經元被啟用（圖2A），並釋放大量具有免疫調節活性的神經肽，如VIP、SP及降鈣素基因相關肽（CGRP），其中CGRP的濃度最高（圖2B）。
這個意外的發現促使他們對與黑色素瘤細胞共培養的TRPV1+傷害感受神經元進行了RNA測序。結果顯示，傷害感受神經元中編碼CGRP的基因Calca和與癌痛相關的基因Trka明顯上調（圖2C）。上調的Trka可提高神經元對疼痛的敏感度，並促使活化的神經元釋放CGRP，這可能是神經元接受癌痛訊號後調節免疫系統的潛在方式。
圖2. 黑色素腫瘤細胞啟用傷害感受神經元
為了進一步探究黑色素瘤細胞啟用傷害感受神經元及其免疫調節的機制，Sebastien等進行了系列細胞實驗，將腫瘤細胞、CD8+T細胞及神經元三類細胞單獨培養或共培養。
實驗結果顯示，與單獨培養的腫瘤細胞相比，與CD8+T細胞或神經元共培養可上調黑色素瘤細胞中Slpi的表達（圖3A）。特別是在三類細胞共培養48h後，培養基中SLPI的濃度竟比單獨培養腫瘤細胞時高200倍（圖3B）。
作為一種分泌性白細胞蛋白酶抑制因子，SLPI不僅可以促進視網膜幹細胞的軸突再生，還能誘導神經幹細胞增殖[10]。然而，SLPI如何作用於傷害感受神經元呢？
為了回答這個問題，Sebastien等利用鈣離子顯微鏡檢測SLPI能否直接啟用傷害感受神經元。結果顯示，SLPI（0.01-10 ng/ml）可啟用至少20%的神經元（圖3C）。前期結果表明活化的傷害感受神經元會釋放CGRP（圖2B），據此，他們推測SLPI可能是黑色素腫瘤細胞啟用傷害感受神經元的關鍵媒介。
黑色素瘤細胞分泌的SLPI濃度為5 ng/ml，而正是5 ng/ml的SLPI可誘導神經元釋放CGRP，而非0.1或1 ng/ml（圖3D）。據此，Sebastien等得出結論，黑色素腫瘤細胞透過分泌SLPI啟用傷害感受神經元，並誘導其釋放CGRP。
圖3. SLPI誘導傷害感受神經元釋放CGRP
上述細胞實驗證明黑色素瘤細胞能誘導傷害感受神經元釋放CGRP，那在腫瘤微環境中這些具有免疫調節活性的CGRP是如何影響免疫細胞呢？
Sebastien等建立了黑素色瘤模型，他們發現荷瘤小鼠對疼痛敏感度與腫瘤浸潤的耗竭性CD8+T細胞數量呈正相關（圖4A）。將小鼠調控痛覺的基因Trpv1敲除後，腫瘤生長速率下降，且荷瘤小鼠的生存期更長（圖4B）。
上述荷瘤小鼠腫瘤組織的流式分析結果顯示，Trpv1敲除小鼠的腫瘤中殺傷性IFNγ+CD8+T細胞更多，耗竭性PD1+LAG3+TIM3+CD8+T細胞更少（圖4C）。相應地，去除CD8+T細胞後，Trpv1敲除抑制腫瘤生長的作用被逆轉了（圖4D）。上述結果說明，敲除Trpv1的抗腫瘤作用是依賴於CD8+T細胞。
圖4. 消融傷害感受神經元可增強抗腫瘤免疫
此前有研究報導，傷害感受神經元釋放的神經肽可抑制與CD8+T細胞的抗細菌免疫[11]。Sebastien等也發現CD8+T細胞會表達CGRP的受體RAMP1，那麼CGRP-RAMP1軸是否是誘導CD8+T細胞耗竭的關鍵訊號通路？
Sebastien等發現，在野生型小鼠中CGRP會誘導CD8+T細胞進入耗竭狀態，降低其對黑色素腫瘤細胞的殺傷力；而在Ramp1敲除小鼠中，CGRP失去了誘導CD8+T細胞耗竭的能力（圖5A-B）。
前期研究表明，敲除Trpv1可抑制黑色素腫瘤生長（圖4B），而新增CGRP則抵消了Trpv1敲除帶來的抗腫瘤效應（圖5C）。根據上述資料，他們推測CGRP與RAMP1結合誘導了CD8+T細胞耗竭。
為了確認這一推測，Sebastien等給荷瘤小鼠注射RAMPI的拮抗劑。他們發現這可有效抑制黑色素瘤的生長，同時保持了CD8+T細胞的免疫活性（圖5D）。
圖5. CGRP驅動RAMP1+CD8+T細胞耗竭
為了進一步說明CGRP-RAMP1通路的重要性，Sebastien等建立了Rag1敲除小鼠的腫瘤模型，然後向其移植野生型或Ramp1敲除小鼠的CD8+T細胞。
他們發現，移植Ramp1敲除小鼠的CD8+T細胞能更好地抑制黑色素瘤生長（圖6A）。而且，其免疫活性也較移植野生型小鼠的CD8+T細胞的更高（圖6B）。也就是說，敲除Ramp1可保護CD8+T細胞的免疫功能，使其免受RAMP1誘導進入耗竭狀態。
進一步，他們分別對野生型與Ramp1敲除小鼠的腫瘤浸潤CD8+T細胞進行了RNA測序。結果顯示，Ramp1敲除小鼠的CD8+T細胞中免疫抑制性訊號分子明顯下調，如Pd1、Tim3、Tox及Eomes。上述結果再次確認了RAMP1可直接誘導腫瘤浸潤的CD8+T細胞功能耗竭。
圖6.RAMP1誘導CD8+T細胞功能耗竭
以上結果在黑色素瘤患者中也得到證實。臨床資料顯示，患者的腫瘤組織中RAMP1表達量越低，他們的生存期就更長（圖7A）。
患者腫瘤組織中浸潤的CD8+T細胞RNA測序結果顯示，高表達RAMP1的CD8+T細胞同時會高表達一些免疫抑制性分子，如PD1，TIM3，LAG3及CTLA4。這些資料說明，RAMP1是腫瘤患者預後不良的標誌物。
圖7. RAMP1是腫瘤患者預後不良的標誌物
總的來說，透過系統的細胞實驗和動物實驗相結合，Sebastien等證實黑色素腫瘤細胞分泌的SLPI驅動傷害感受神經元釋放CGRP，進而透過CGRP-RAMP1訊號軸誘導CD8+T細胞耗竭，從而促進黑色素腫瘤生長。
他們發現，活化傷害感受神經元分泌的神經肽是感覺神經促進腫瘤生長的關鍵紐帶，深入揭示了腫瘤細胞、傷害感受神經元以及CD8+T細胞三者間的相互作用。