神經精神疾病一直以來缺乏明確的腦病理，並且在很大程度上受遺傳調控，ASD（自閉症譜系障礙）作為其中的一類疾病也不例外，所涉及的風險基因多達上百個，因此患者發病的病因有很大的異質性[1,2]。

最近的一些研究報導了大部分ASD患者大腦額葉皮層和顳葉皮層中存在一致的轉錄組和表觀組異常調控模式，這表明ASD儘管病因異質性較大卻可能有較為一致的分子病理[3,4]。但ASD中一致性的分子病理究竟是隻限於大腦皮層區域性，還是廣泛存在於大腦皮層中仍然需要進一步的研究。

近日，由加州大學洛杉磯分校的Daniel H. Geschwind和Michael J. Gandal領銜的研究團隊，在《自然》期刊上發表重要研究成果[5]。

他們分析了725份來自112個ASD患者以及正常人遺體的大腦樣本，涵蓋11個不同的大腦皮層區域，利用樣本的RNA測序資料，他們發現在大腦皮層中存在廣泛的轉錄組變化，並且呈現出從前到後（額葉到枕葉）越發明顯的趨勢，這比以前所知的要廣泛得多。後續的單核RNA測序資料和甲基化譜則表明，上述分子特徵主要影響了興奮性神經元以及神經膠質細胞。

研究人員還認為，這個研究表明，大腦中的廣泛的RNA變化可能是ASD的原因，而不是這種疾病的結果[6]。

論文首頁截圖

Geschwind團隊首先對725份涵蓋11個大腦皮層區域（其中包含了額葉、頂葉、顳葉、枕葉四個皮層小葉）的樣本進行了RNA測序，這個樣本量幾乎是以往研究的3倍，這些樣本來自49個ASD患者的遺體和54個相匹配的健康人遺體。

得益於樣本量增加帶來的統計力增大，研究人員透過比較兩組樣本的基因表達譜，以及由可變剪接產生的同一個基因的不同轉錄本的表達水平，發現了4223個基因以及9474個轉錄本在整個大腦皮層範圍有顯著的差異表達，並且基因轉錄本的差異效應比基因要大，表明可變剪接ASD中有著重要作用。

各個皮層區域以及皮層整體上的ASD患者和正常人之間的差異表達基因和轉錄本數量

為了比較各個皮層區域與皮層整體上的一致性，研究人員計算了各個皮層區域中的ASD患者和正常人之間的差異表達基因和轉錄本。

儘管各個皮層區域的差異表達基因和轉錄本數量不一致，但是11個皮層區域的基因差異效應大小與皮層整體是一致的。其中位於枕葉的初級視皮層（BA17）最明顯，BA17有3264個差異表達基因，而有59%都是皮層整體上的差異表達基因。

皮層各個區域與皮層整體基因差異效應大小的一致性

Geschwind團隊還在83份來自9例母源15q11-q13重複綜合徵（是ASD的一種常見型別）患者遺體的大腦皮層樣本中，進行了上述的差異表達分析，他們發現這些樣本中的基因差異效應與前面皮層整體基因差異效應是一致的。

上述研究結果表明，ASD患者大腦皮層中的轉錄失調所呈現的分子病理廣泛存在於大腦皮層的各個區域，而並不只限於區域性。

在正常人的大腦組織中，皮層的各個區域之間存在差異明顯的基因表達模式，這主要反映了不同區域的細胞結構和功能的差異。Geschwind團隊在之前發表的工作中報導了ASD患者的額葉皮層和顳葉皮層之間差異表達的基因顯著減少，他們將這種現象稱為皮層不同區域的轉錄組特性衰減（ARI）。ARI表明ASD患者的額葉皮層以及顳葉皮層的功能，以及區域之間的連通性發生了變化。

為了探究ARI是否在ASD患者大腦皮層中廣泛存在，研究人員在正常人樣本和ASD患者樣本中分別選取了相應的55對不同的皮層區域，透過比較不同區域的基因表達譜，分別計算正常人和ASD患者相對應的不同皮層區域之間的差異表達基因數量，得到ARI的量化描述，然後再以正常樣本和患者樣本之間本身的差異表達基因數量分佈，作為背景來衡量ARI的顯著性。

最後研究人員發現了10對皮層區域之間發生顯著的ARI，這表明ASD患者的大腦皮層更傾向於分子水平同質化。在10對發生顯著ARI的區域中有9對都包括了BA17或者BA39/40。

發生顯著ARI的10對皮層區域

為了研究發生ARI皮層區域中基因表達的變化，研究人員根據區域間基因差異效應以及相應的正常樣本和患者樣本間的差異效應，選出了導致ARI的代表性基因。

儘管這些基因在皮層各個區域中存在廣泛的異常調控，但是在靠後的區域BA17和BA39/40中表現出了更大的變化，即正常人樣本中原本應該在BA17和BA39/40中出現相對於其他區域更高或更低的表達的基因，在ASD患者樣本中則和其他區域的表達量幾乎一致。

Geschwind團隊還對ARI基因作了進一步的分析，他們按照在正常人樣本的皮層區域中從前到後表達量升高或者降低，而在ASD患者樣本的各個皮層區域不發生變化，將ARI基因分為了ARI上調基因和ARI下調基因。他們發現，不論哪一類基因在皮層靠後的區域（BA17、BA39/40）中，ASD患者樣本相對與正常人樣本都有著更大的變化。

ARI下調（上圖）和上調（下圖）基因在皮層靠後區域中ASD患者樣本（橙色）相對於正常人樣本（綠色）的變化更大

這表明原本存在於大腦皮層中從前到後的基因表達梯度，在ASD患者的皮層中衰減消失了。

接著，為了識別在ASD患者大腦皮層中出現協同變化的基因模組，Geschwind團隊對所有大腦皮層樣本的基因表達資料做了基因共表達網路分析（WGCNA），當然分析的基因表達資料還包括可變剪接產生的轉錄本表達譜。

結果他們在ASD患者樣本中一共發現了38個至少在一個皮層區域出現上調或下調協同變化的基因模組。這些模組大部分可分為兩類：（1）在所有皮層區域中都有較為一致的協同變化的基因模組為18個；（2）在不同的皮層區域協同變化有較大差異的基因模組為13個。

在第一類基因模組中有兩個模組——GeneM5（基因模組）和IsoformM37（轉錄本模組）還顯著富集了ASD相關的常見遺傳變異。GeneM5在ASD中下調，其中包括許多與突觸囊泡功能和細胞骨架，以及突觸可塑性相關的基因，甚至還顯著富集了一些會發生與ASD相關的罕見的功能破壞性遺傳變異的基因，例如GRINA、MYO5A以及BTRC。IsoformM37則在ASD中上調，其中包括與熱休克反應和蛋白質摺疊相關的基因。

 

在ASD患者大腦皮層各個區域協同變化一致性較高的基因模組

第二類基因模組中，沒有任何一個基因模組富集已知的ASD相關遺傳變異。但是其中有12個基因模組顯著富集前面提到的ARI基因，表明這些基因模組在正常人大腦皮層中應該代表著各個區域的轉錄組特性，而在ASD中這種特性消失了。

12個基因模組中有6個在正常人大腦皮層中靠後區域高表達（相對於靠前區域），但在ASD患者大腦皮層中則出現了下調，有4個則是在正常人大腦皮層中靠前區域高表達，但在ASD患者大腦皮層中出現了上調。

在ASD患者大腦皮層各個區域協同變化並不一致的基因模組

這些結果再一次表明，ASD患者大腦皮層靠後區域中發生了遠比靠前區域嚴重的轉錄失調，從而導致了ARI。

結合以往的報導，Geschwind和他的同事推斷產生這種現象的原因可能是：大腦皮層靠後區域例如BA17相比於皮層其他區域是神經元最密集的區域，在小鼠和靈長類動物的大腦皮層中觀察到神經元密度也有從前到後增加的梯度。因此由ASD帶來的轉錄失調嚴重性與皮層區域中神經元密度有關。

他們還透過分析ASD患者大腦皮層中轉錄組的變化，和以往報導的靈長類動物皮層各個區域的神經元密度資料的關聯性證實了上述推斷。

Geschwind團隊推測，ASD相關的基因轉錄的大範圍失調，很有可能反映了皮層中各種細胞比例的變化。那麼真相究竟是否如此呢？

為搞清楚上述問題，他們對來自6個有明顯基因差異表達特徵的ASD患者，和6個匹配的正常人大腦皮層的250000個細胞核進行了單核RNA測序，這些細胞涵蓋了額葉、頂葉和枕葉皮層。透過對snRNA-seq資料的聚類，他們識別到了26種不同的細胞類群，這基本上代表了所有在大腦皮層中出現的細胞型別。

snRNA-seq聚類得到26種細胞型別

接著，Geschwind團隊比較了ASD患者和正常人大腦皮層中26種細胞型別的比例，沒有發現在FDR校正後仍然顯著的細胞比例變化，只有星形膠質細胞比例在ASD患者樣本中出現了微弱的上升（FDR>0.18）。

他們還利用之前獲得的包含72個個體（ASD患者和正常人各36個）的bulk-seq的甲基化譜做了細胞型別分解，比較之後同樣沒有發現顯著的細胞比例變化。

Geschwind團隊還考慮了在前面差異基因計算中加入皮層細胞比例，作為協變數來分析細胞比例對差異基因的影響，結果發現細胞比例加入前後基因差異效應log2FC高度相關（ρ>0.7），這些結果表明細胞比例的變化並不能解釋在ASD患者大腦皮層中廣泛存在的轉錄失調。

他們推測前面發現的ASD相關的轉錄失調，有可能反映了細胞型別特異的基因表達變化，於是他們對在snRNA-seq中發現的26中細胞型別分別計算了細胞特異差異表達基因。結果他們再次觀察到了皮層的梯度變化——從前到後差異基因越來越多。其中興奮性神經元擁有最多的差異基因，並且在枕葉中的興奮性神經元更為顯著。


在研究的最後，Geschwind團隊還觀察到前面基因共表達網路分析發現的96個基因和轉錄本模組中，有90個都顯著富集了細胞特異差異基因。

上述結果表明，細胞型別特異的基因差異表達很大程度上導致了ASD患者大腦皮層中廣泛存在的轉錄失調，而細胞型別比例的變化帶來的影響很小。

總的來講，這項研究透過一個更大規模的涵蓋ASD患者大腦皮層四個小葉的樣本佇列，證明了轉錄失調在ASD患者大腦皮層中廣泛存在，並且靠後區域的轉錄失調比靠前區域嚴重，而這種廣泛的轉錄失調背後是皮層中細胞型別特異的基因轉錄失調。

來自： 奇點神思