如何解決冷凍電鏡（cryo-EM）中最頭痛的取向優勢？

冷凍電鏡單顆粒分析從二維投影圖獲得三維密度圖有一個基本前提：獲得具有足夠取向的全同顆粒。這個“足夠取向”一般而言不需要全空間的投影圖，只需要實驗所獲取的取向能夠充分填充三維密度圖傅立葉變換的係數即可。在最低的要求下，只需要繞著單軸旋轉180度即可。然而，事實上在冷凍電鏡的實驗中，有大量情況只有一個或少數幾個主導取向。如何解決取向優勢是冷凍電鏡實驗和資料處理中遇到的最麻煩的問題之一。下面我們就簡單總結一下可能的解決途徑： 可能的解決方案： 1. 樣品自身性質的改變： 1.1 突變、截短或插入肽段： 重點考慮的物件為那些位於表面的帶電氨基酸或暴露在外面的疏水肽段。以二型分子伴侶素為例，在頂部的蓋子結構域有部分疏水氨基酸暴露，戒掉蓋子的伴侶素取向會明顯變好。 1.2 蛋白表面殘基的修飾（如甲基化等） 1.3 交聯試劑： 例如，0.01%-0.05%戊二醛制樣前冰上處理5min左右；或使用較溫和的BS3處理30min-1小時。 1.4 與 co-factor 、抗體等形成複合物 2. 溶液性質改變： 2.1 緩衝液基本性質的改變： 鹽濃度、pH值、緩衝試劑型別 2.2 新增去汙劑： 不要認為只有膜蛋白需要去汙劑，對於一些親水蛋白，有可能會有區域性的少數疏水氨基酸暴露，新增極少數的去汙劑不僅可以使得蛋白溶液更容易形成冰層，而且有可能改變蛋白自身的表面性質，從而解決取向優勢。去汙劑必須為溫和型，否則有可能嚴重影響蛋白結構。Triton X-100，NP-40，Tween-20，Digitonin等。 2.3 新增氨基酸（比如甘氨酸）或其它有機小分子： 2.4 增加冰層厚度： 很多蛋白分子不一定為近似圓形，有時候最長和最短的方向能差好幾倍。由於冰層上下厚度的限制，當冰層和分子尺寸相當時，很多分子會優先“平躺”，也即Z-軸方向為分子較短的方向。經驗表明，對這種情況增加冰層厚度可以有效增加取向，同時也保護了樣品不被冰層表面張力損壞。在不影響目標蛋白前提下，可以考慮混入穩定的病毒或核糖體增厚冰層。 3. 載網及處理： 3.1 嘗試不同載網及同一種載網不同型號： Quantifoil和C-flat Holy Carbon grid、微篩載網（Lacey carbon grid）、純金載網（UltraAuFoil ）(Russo andPassmore, 2014, 2016) 更多有關載網的資訊可參照（此處非廣告！）： http://www.quantifoil.com/index.php?name=products 3.2 額外支援膜： 例如純冰或加額外的支援膜。額外的支援膜可以是無定形碳膜（amorphous carbon layer）或石墨烯（Graphene）或氧化石墨烯（Graphene Oxide）。氧化石墨烯改變取向最成功的例子可參看(Boland et al., 2017)。 3.3 輝光放電（ glow discharge ）和等離子清洗（ plasma cleaning ）條件。 例如可是嘗試在不同氣體環境：比如空氣或在正戊胺（N-amylamine）(Nguyen et al., 2015)環境下做輝光放電，或氫氣、氧氣等環境做等離子清洗。不同氣體解離形成不同電荷，比如H2解離帶形成H+帶正電，O 2 解離形成O 2- 帶負電等，這樣可以改變載網親水處理之後的表面性質，從而改變與蛋白質的相互作用，最終使得被成功吸附的蛋白分子取向分佈出現顯著變化。 3.4 抗體親和載網法： 具體可參見(Yu et al.,2016; Yu et al., 2014)。 3.5 Polylysine 處理： 具體可參見(Lander et al., 2012; Zang et al., 2016) 4. 資料收集和處理策略 4.1 暴力破解法： 此方法就是所謂的狂收資料策略。不過這個有一個前提，就是目標蛋白除了主要的取向，其它稀有取向概率分佈並不為零；有些情況，例如一些環狀結構，只有正面影象，沒有側檢視，這種情況，完全無法使用狂收資料的方式解決。具體情況如何，必須在處理完2D分類之後再具體分析。 4.2 資料處理平衡取向： 當然這個是基於上條的暴力破解。簡單說就是大量2D分類之後，把主要的優勢取向混合，然後隨機扔掉大部分顆粒。這個過程具體扔掉多少要看取向有多嚴重，以及自己有多少顆粒（百萬級土豪隨意）。具體操作，可以通過嘗試法不同比例看那個結果最好，比方95%，90%，85%，80%，70%，60%，50%都試一下，只要有足夠的計算資源，這是最有效的捷徑。這個過程可以應用到3D，也可以迭代，也即等有了好的reference之後，取向也算的更加準確，這個時候把以前扔掉的顆粒再重新撿回來處理，再扔，再處理，直到滿意為止。具體細節可參照dynactin(Urnavicius et al., 2015)和動力蛋白dynein（Zhang et al 2017） 冷凍電鏡資料處理 ，更多細節可email: kzhang@mrc-lmb.cam.ac.uk 4.3 傾轉樣品臺： 一般而言，蛋白分子在平面內360度分佈是完全均勻的，但是這沒有意義，所有的取向都是旋轉等價的，並不會貢獻任何新的傅立葉資訊。傾轉可以大量增加有效取向，即使原來只有一個取向，也會轉換為大量互不等價的取向。比如0度時在兩極分佈（就相當於地球的南北極），通過50度傾轉樣品臺，分佈變為整個北緯40度繞地球一圈（如果能繞赤道走一圈，就相當於完全沒有取向優勢，這等價於傾轉90度，實際實驗不可行）。傾轉樣品drift非常嚴重，要求grid的機械性質保持良好、不彎不折、無裂紋，樣品自身分散要好，不要呈現大量團狀聚集，冰層厚度儘量平整均一等等。 4.4 傾轉資料後處理： 傾轉樣品兩個關鍵因素就是drift和CTF。Drift可使用最新版的Motioncorr2中Patches功能，把Movie劃分為若干小區域處理。CTF可以在做完Drift correction，挑完顆粒之後，有了座標檔案之後（.box或.star均可），用Gctf(Zhang, 2016)的local CTF功能做local refinement；也可以只算全域性CTF，然後按樣品臺傾轉引數+顆粒座標計算欠焦量補償值，然後把這個補償值新增到全域性CTF。