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染色質免疫共沉澱(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)，是研究體內蛋白質與DNA相互作用的經典方法。
想要獲得理想的ChIP結果，選擇適合的抗體固然很關鍵，ChIP 流程中所有步驟也很重要。本文對ChIP實驗之前的準備、獲得理想ChIP結果步驟、ChIP的qPCR定量分析和ChIP案例分析進行總結，希望幫助到正在做ChIP實驗和qPCR定量分析的您。
開始 ChIP 之前要考慮三件事
（1）為您的實驗查詢適合的抗體
（2）優化染色質剪下
（3）評估您的 ChIP 實驗能否成功
五個步驟獲得理想 ChIP 結果
Step1：交聯和裂解——穩定複合物並分離核組分
第一步對時間要求嚴格並且需要優化。體內共價交聯穩定蛋白質-DNA相互作用並於特定時間點進行分析。通常採用甲醛交聯，加入甘氨酸以終止反應。交聯劑滲透到完整細胞中並將蛋白質-DNA複合物鎖定在一起從而進行分析。交聯劑在整個過程中保持複合物穩定，但其作用必須是可逆的才能用於ChIP。一些非常穩定的蛋白質-DNA相互作用則不需要交聯。
接下來，使用裂解液透化細胞膜，釋放細胞組分，然後蛋白質-DNA複合物變得可溶。去除細胞溶質蛋白以減少背景訊號並增加靈敏度。
注意：此時可以停止ChIP測定。 經過交聯，淬滅和洗滌細胞沉澱後，將裂解物於-80℃儲存。
Step2：染色質片段化——DNA片段化
細胞核材料片段化是獲得良好的ChIP 解析度的關鍵因素，理想情況下的片段大小在 200 到 800 bp對之間。剪下是最難控制的步驟之一。通過超聲處理和/或核酸酶/酶促消化可以實現剪下，各有利弊。超聲處理需要大量的手動操作時間，但非常適合難以裂解的細胞；酶促消化不需要手動操作，適用於大量樣品的處理，但其剪下位點不是隨機的。兩種方法都需要根據具體細胞系進行優化。
注意：此時可以停止ChIP。經過剪下/消化染色質後，可以將樣品於-80°C儲存。避免反覆凍融。
Step3：免疫沉澱——捕獲並分離蛋白質-DNA複合物
使用抗體捕獲蛋白質-DNA複合物中的目標蛋白質是實驗成功的關鍵因素。抗體免疫沉澱並從細胞核組分中分離蛋白質，去除不相關的細胞物質。
使用抗體結合磁珠完成所得抗體-蛋白質-DNA複合物的純化。經過孵育後，充分洗滌磁珠-抗體-蛋白質-DNA複合物，純化並洗脫蛋白質-DNA複合物。
Step4：製備DNA——解交聯和DNA純化
現在含有目標蛋白質的染色質片段已分離，需要解交聯並純化DNA。解交聯通常採用高熱孵育和/或消化來完成。
注意：此時可以停止ChIP。經過解交聯和/或DNA純化後，可以將樣品於-20°C儲存。
Step5：定量DNA——測定目標蛋白質-DNA水平
在該步驟中，通過qPCR定量純化的DNA產物，通過qPCR，您可以確定目標蛋白是否存在於特定位點。
ChIP的qPCR如何定量分析
ChIP-qPCR 資料需要針對可變性來源進行標準化，包括染色質數量、免疫沉澱的效率（富集效率）和 DNA 回收率。
兩種常用的標準化 ChIP-qPCR 資料方法——Percent Input法和富集倍數法（Fold Enrichmen）。與input相關的ChIP-qPCR資料包括ChIP的背景水平和input染色質的標準化。建議ChIP 實驗重複，儘可能將結果與背景訊號和標準誤差一起顯示。
Percent Input法
使用這種方法，從ChIP獲得的訊號除以從input樣本中獲得的訊號。input樣本代表ChIP中使用的染色質數量。通常1%的起始染色質用作input。
示例：計算input百分比
注意：如果起始input為1%，則從稀釋input的Ct值中減去100或6.644 cycles（100的log2）的稀釋因子（DF）。
富集倍數法
這種標準化方法也稱為“背景訊號”或“相對無抗體對照”。該方法將ChIP 訊號除以無抗體訊號，將ChIP訊號表示為訊號相對於背景訊號的倍數增加。該方法建立在背景訊號的水平在不同的引物組、樣品和重複實驗間可重複的假設上。背景訊號水平在引物組、樣品和實驗之間有所不同。
示例：富集倍數計算
ChIP案例分析
專案文章｜ChIP實驗分析揭示H3K27me3去甲基化酶在體細胞重程式設計調控轉錄機制
2020年10月8日，中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院/生物島實驗室秦寶明教授團隊和Miguel A. Esteban課題組在Nature Communications雜誌發表了題為"JMJD3 acts in tandem with KLF4 to facilitate reprogramming to pluripotency"的研究論文，該成果揭示了H3K27me3去甲基化酶JMJD3與KLF4在體細胞重程式設計中協同調控轉錄新機制，深圳易基因提供本研究中的部分測序分析服務。
標題：JMJD3 acts in tandem with KLF4 to facilitate reprogramming to pluripotency
發表時間：2020年10月8日
期刊：Nature Communications
影響因子：14.919
技術方法：ChIP-seq、RNA-seq、RT-qPCR等
作者通過對小鼠體細胞重程式設計過程中進行轉錄組和ChIP-seq等測序分析，揭示了H3K27me3去甲基化酶JMJD3與KLF4在體細胞重程式設計中協同調控轉錄新機制。首先，JMJD3對重程式設計有2方面相反的作用；在機制上，JMJD3被KLF4特異性地招募至上皮和多能性基因位點，並輔助KLF4啟用這些基因。進一步，作者還在多種其他KLF4介導的細胞命運轉變中驗證了JMJD3的這一作用模式。因此，本研究對深入理解KLF4和JMJD3在相關發育、幹細胞分化、生理和疾病條件下的複雜作用具有提示意義。
關於染色質免疫共沉澱測序技術（ChIP-Seq）
將ChIP與高通量測序技術相結合的ChIP-Seq技術，可在全基因組範圍對特定蛋白的DNA結合位點進行高效而準確的篩選與鑑定，為研究的深入開展打下基礎。
不同組蛋白的差異性修飾與基因的轉錄、染色質的空間構型和構象密切相關。運用某一修飾的特定組蛋白的特異性抗體富集與其結合的DNA片段，並進行純化和文庫構建，然後進行高通量測序，通過將獲得的資料與參考基因組精確比對，研究人員可獲得全基因組範圍內某種修飾型別的特定組蛋白與基因組DNA序列之間的關係，也可對多個樣品進行差異比較。
技術優勢：
（1）篩選範圍廣：全基因組範圍內篩選特定組蛋白修飾與基因組DNA序列之間的關係
（2）微量樣本：只需5ng以上免疫沉澱後的DNA，即可展開測序分析
（3）方案靈活：根據不同的專案需求，選擇不同的組蛋白修飾特異性抗體
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參考：
- thermofisher
- http://doi.org/10.1038/s41467-020-18900-z
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原文解讀：