一句話評價：小樣本量單細胞轉錄組在冷門疾病領域應用前景尚可，常規套路也能發NC
1. Title
標題可以看出本研究的主要內容：①構建成纖維細胞的圖譜/揭示成纖維細胞的異質性；②找到一群（相對於正常樣本）在纖維化皮膚病中含量升高的間充質成纖維細胞
2. Background
- 纖維化的特點是成纖維細胞增殖、遷移、侵襲能力增加以及胞外基質 (ECM) 的過度積累，在全球範圍內都有較高的發病率和死亡率。 纖維化皮膚病主要是 ECM 在真皮中積累
- 纖維化可影響任何器官，導致進行性組織瘢痕形成和器官功能障礙
- 迄今為止，纖維化皮膚病的發病機制尚未完全闡明，仍缺乏根治性治療方法
- 尚缺乏關於 scRNA-seq 探索纖維化皮膚病成纖維細胞異質性的研究
——> 所以要做single cell
3. Results
3.1. 單細胞測序揭示正常傷疤和纖維皮膚病瘢痕的(真皮層)細胞異質性
keloid在此處表示瘢痕/“病灶”
都是很常見的圖：
- a.流程圖，比一般情況多了酶解這一步，目的是消除表皮層的細胞
- b.umap降維，展示cluster註釋資訊
- c.層次聚類，表示cluster表達譜的相似性
- d.各種細胞組分在每個樣本中的佔比
3.2 成纖維細胞被分為4群，其中間充質型別的成纖維細胞在疾病組織中增多
- a, c, d, e. 在上一步的基礎上，提取出成纖維細胞重新降維， 聚類。結合已有文獻，最終註釋為4群，其中間充質成纖維細胞表達一些間充質祖細胞marker，如 COL11A1 和 POSTN，它們參與骨骼系統發育、骨化或成骨細胞分化。促炎成纖維細胞的特徵包括炎症反應、細胞趨化性和膠原蛋白表達減少
- f. 只有間充質型別的成纖維細胞(Mesenchymal fibroblasts,MF)在疾病組織中升高
- h. 對比這種MF在疾病、正常之間的差異，發現疾病狀態下，MF高表達骨骼系統發育、骨化相關通路和基因，比如COL11A1, COMP, POSTN
不知道大家讀到這裡有沒有跟我一樣的困惑：①某個細胞型別和其他細胞型別做對比，②這種細胞內部不同condition做對比，得到的差異基因和通路這麼像？！
3.3 疾病組織中，間充質成纖維細胞的特徵
（也就是在疾病組織中，將MF和其他成纖維細胞做對比）
- b. 差異基因
- d. 差異通路主要分了三塊：膠原蛋白(ECM的成分)相關、傷口癒合相關、骨化相關
- e. 這個圖是看的轉錄調控，並沒有採用常見的單細胞轉錄組中分析轉錄調控的方法。右邊的小提琴表示TF在MF與the rest之間的表達差異。左邊的圖，每個TF對應一行，一行裡面有兩小行，列表示按照logFC排序後的基因，越往左表示MF中高表達的基因，越往右，表示the rest中高表達的基因。如果某個調控網路(TF加靶基因)在某個群中存在，則應該滿足：TF高表達、TF正向調控的基因高表達、TF負向調控的基因低表達。以SCX為例，它在MF中高表達，它啟用的基因(紅色表示)在MF中高表達(因為這些基因排在左邊)，它抑制的基因(藍色表示)在MF中低表達(因為這些基因排在右邊)，結合這幾點共表達資訊，就支援了MF中存在SCX的調控網路。通過這個分析，找到了MF中特有的調控網路，並和它上調的通路是吻合的。
- 熒光染色驗證這群MF在疾病組織中存在，在正常組織中很少
3.4 細胞通訊分析
- 找到了疾病組織中顯著的interaction
- 探究MF在細胞互作中所起的角色，MF有哪些重要的interaction
3.5 疾病真皮組織中MF通過POSTN促進膠原蛋白的表達
接著是做了一點點機制。關於為什麼要做這個基因，正文沒有說太多，只說是：①這個基因在MF中高表達；②此前已有一些報導稱POSTN可以促進瘢痕組織的形成，可以促進膠原蛋白(一種ECM成分)的產生。
- a. 通過單細胞轉錄組分析中得到的marker，將成纖維細胞分選為MF和other fibroblasts
- d. 對這兩組細胞做了bulk RNA-seq，證明分選效果比較好，得到了想要的細胞
- g. 將兩組細胞培養後，取上清液加到other fibroblasts裡面，發現MF的上清液能使兩種膠原蛋白表達升高
- h. 加入POSTN的中和抗體後，這種現象被抑制了
通過一正一反的實驗就證明了MF通過POSTN促進膠原蛋白表達的結論
3.6 MF的兩個子類有什麼關係
在3.2中，其實是把兩個子類都歸為MF了，這一部分就探究了它倆的關係。
- a, b. diffusion map，這裡只能看出降維資訊，兩類並不重合
- c. mesenchymal progenitor marker genes在cS4中高表達(說明cS4可能是更早期的狀態)
- d. RNA velocity分析給出了幾條可能的轉化路徑
- f. 比較了cS4和cS1的差異，發現cS4更加具有間質特徵
3.7 其他資料集也能發現這種MF細胞
- a. 別人的資料集(硬皮症，也是一種纖維化皮膚病)的降維註釋結果；本研究中某個正常樣本資料集的降維註釋結果
- b, c. 提取上一步分析中兩個資料集的成纖維細胞，整合，降維聚類
- d. MF的marker基因在降維圖中的投影，發現在cluster 7中，這些marker高表達，且疾病組織比正常組織高表達
- e. cluster 7與本研究中4種成纖維細胞亞群的相關性熱圖，cluster 7和MF的相關性最高
結論是其他資料集也能找到這種MF，說明纖維化皮膚病存在一種廣泛的致病機制
4. ref
Single-cell RNA-seq reveals fibroblast heterogeneity and increased mesenchymal fibroblasts in human fibrotic skin diseases
（2021.10.22組會分享的文獻，因為準備時間有限，就選了這一篇較簡單的）
我之前有想過一個問題，對於單細胞轉錄組資料，兩組比較之後，如果已經找出有丰度差異的亞群，接下來的重點是：
①研究這一群的特徵
還是
②比較這一群裡面兩組之間的差異
我當時是覺得①更好，因為把這種亞群的特徵研究清楚了，反映的就是組間差異（富含這種亞群的condition，也具有更明顯的這種亞群的特徵）。另一方面②中的比較，因為細胞註釋是相同的，這樣做可能得不出什麼差異或者差異很小(假設雖然有丰度差異，但都有一定的細胞量)。
這篇文獻的前半部分cluster之間以及condition之間的比較都得出相似的結果，跟我之前想的有點不一樣...
因水平有限，有錯誤的地方，歡迎批評指正！