外泌體 (exosomes) 是由哺乳動物細胞通過“內吞-融合-外排”等機制，主動向胞外釋放的奈米級 (直徑40~60 nm) 雙層囊泡小體，攜帶蛋白質、核酸、脂質等多種生物活性分子。越來越多的證據表明，外泌體是細胞間交流的重要媒介，它們可以將功能性分子轉移到受體細胞中，或參與受體細胞膜受體介導的訊號傳導 。此外，由於外泌體在體液中很容易獲得，常作為非侵入性液體活檢的重要內容，以幫助識別疾病和評估治療反應。而外泌體的天然分子轉運特性以及良好的生物相容性，也令其在藥物載體、遞送、治療等領域存在巨大應用潛力。
儘管外泌體具有重要的生物學和轉化意義，但目前仍然缺乏能夠準確識別外泌體的蛋白質生物標誌物。近日，德克薩斯大學安德森癌症中心的Raghu Kalluri教授等人，在Nature Cell Biology (IF=28.8) 發表研究論文“Quantitative proteomics identifies the core proteome of exosomes with syntenin-1 as the highest abundant protein and a putative universal biomarker"[1]，該研究工作利用super-SILAC、高解析度質譜技術對14種人類細胞系外泌體進行了蛋白質組學分析，共定量了1200餘種蛋白質，並且發現Syntenin-1蛋白不僅含量最高，並且普遍存在於各種細胞外泌體中，而傳統標誌物四次穿膜蛋白 (CD9/CD63/CD81) 的表達量則在細胞外泌體間具有明顯差異。因此，Syntenin-1更適合作為外泌體標誌物。
1CD9, CD63, CD81在不同細胞外泌體的表達差異
研究人員首先從14種細胞系中通過普通超速離心 (UC) 分離得到外泌體，這些細胞系包括：良性上皮細胞 (HEK293T, HPDE, HPNE, MCF10A)、惡性上皮細胞 (BxPC3, PANC-1, MCF7, MDA-MB-231)、間充質細胞 (BJ, mCAF, PSCs)、T淋巴細胞 (Jurkat)、B淋巴細胞 (Raji)、單核細胞 (THP-1)。隨後，利用流式細胞技術，檢測不同細胞外泌體傳統標誌物CD9/CD63/CD81的表達情況，結果表明，這些四次穿膜蛋白並未表達於所有型別細胞外泌體中。比如，HPNE, Jurkat, Raji中未檢測到CD9；BxPC3中不存在CD81。這一結果也促使研究人員進一步尋找不同來源外泌體中普遍存在的蛋白質標誌物。
圖1 CD9, CD63, CD81在不同細胞外泌體中的表達情況
2 質譜鑑定細胞系外泌體蛋白質組特徵
隨後，研究人員使用super-SILAC (細胞培養條件下穩定同位素標記) 聯合高解析度質譜技術對14種細胞系外泌體蛋白質進行全面定量分析 (圖2a)，最多定量檢測到2,500種蛋白質 (圖2b)，其中1,243個蛋白質普遍存在於所有細胞系外泌體中 (圖2c)。PPI分析發現這1,243個蛋白質間大多存在相互作用 (圖2d)。GO富集分析則表明，這些蛋白質功能主要與膜泡，核酸結合，新陳代謝和胞內運輸等功能有關 (圖2e)，其中，90%的蛋白質與ExoCarta資料庫中人源蛋白質一致 (圖2f)。基於這些蛋白質的表達丰度，研究人員進一步分析得到了28個高丰度蛋白質以及21個低丰度蛋白質，他們分別可以作為潛在的外泌體識別、排除標誌物。
圖2 細胞外泌體的蛋白質組學檢測
3 不同外泌體分離方法對鑑定結果影響較小
考慮到分離方法對外泌體純度和得率影響較大，因此，研究人員在此前UC方法的基礎上，還利用密度梯度超速離心 (OptiPrep-based DG) 和尺寸排阻色譜 (SEC) 從HEK293T、MDA-MB-231、PANC-1三種細胞系中分離外泌體進行蛋白質組檢測 (圖3a)，最多定量檢測到約2,600個蛋白質 (圖3b)，約70%的蛋白質可以在三種不同分離方法得到的外泌體中重複鑑定到 (圖3d)，表明每種分離方法都能識別出大部分的外泌體蛋白質。主成分分析顯示，生物學重複間的外泌體蛋白質組高度相似，且不同型別細胞間的外泌體蛋白質差異度明顯大於分離方法產生的差異 (圖3e)。而對於此前鑑定到的1,243個外泌體中普遍存在的蛋白質，研究人員發現有1,212個存在於DG、SEC分離得到的外泌體中。類似地，前期得到的外泌體識別、排除標誌物也進一步分別縮減至22個和15個。
圖3 AML細胞早期/晚期治療抵抗過程中蛋白質及磷酸化修飾水平的改變
4 Syntenin-1是外泌體中含量最豐富的蛋白質
在所有22個潛在的外泌體識別標誌物中，Syntenin-1 (SDCBP) 始終是丰度最高的蛋白質 (圖4a)，western blot結果的確發現Syntenin-1存在於各種細胞系外泌體中 (圖4b)，以及不同分離方式得到的外泌體中 (圖4d, e)。為了進一步驗證Syntenin-1作為外泌體標誌物的普適性，研究人員從三種細胞系中分離得到了凋亡小體、細胞微泡、外泌體，發現Syntenin-1僅存在與外泌體中 (圖4f)。而在人血漿、尿液以及其他哺乳動物細胞系、血清樣本中，Syntenin-1均表達於外泌體中。
圖4 Syntenin-1是外泌體的通用生物標誌物
總的來說，此項研究通過檢測多種細胞系外泌體蛋白質組，提供了外泌體全面定量蛋白質圖譜，在此基礎上，細緻地評估了常見外泌體分離方式對蛋白質鑑定結果的影響，證明CD9/CD63/CD81實際上並不能作為外泌體的通用標誌物，而Syntenin-1則無一例外地存在於不同物種、不同樣本來源的外泌體中，突出了Syntenin-1作為外泌體生物標誌物的重要意義。
參考文獻：
1, Fernanda G Kugeratski, et al. 2021. Quantitative proteomics identifies the core proteome of exosomes with syntenin-1 as the highest abundant protein and a putative universal biomarker. Nat Cell Biol.