活體生物發光成像技術原理及應用

一、技術原理

1. 標記原理

哺乳動物生物發光，一般是將 Firefly luciferase 基因（由 554 個氨基酸構成，約 50KD）即熒光素酶基因整合到預期觀察的細胞染色體 DNA 上以表達熒光素酶，培養出能穩定表達熒光素酶的細胞株，當細胞分裂、轉移、分化時, 熒光素酶也會得到持續穩定的表達。基因、細胞和活體動物都可被熒光素酶基因標記。將標記好的細胞接種到實驗動物體內後，當外源（腹腔或靜脈注射）給予其底物熒光素 (luciferin)，即可在幾分鐘內產生髮光現象。這種酶在 ATP，氧存在的條件下，催化熒光素的氧化反應才可以發光，因此只有在活細胞內才會產生髮光現象，並且發光光強度與標記細胞的數目線性相關。

除 Firefly Luciferase 外，有時也會用到 Renilla Luciferase。二者的底物不一樣，前者的底物是熒光素（D-luciferin），後者的底物是 coelentarizine。二者的發光波長不一樣，前者所發的光波長在 540~600nm，後者所發的光波長在 460~540nm 左右。前者所發的光更容易透過組織，後者在體內的代謝比前者快，而且特異性沒有前者好，所以大部分活體實驗使用 Firefly Luciferase 作為報告基因，如果需要雙標記，也可採用後者作為備選方案。

熒光素酶的發光是生物發光，不需要激發光，但需要底物熒光素。熒光素在氧氣、ATP 存在的條件下和熒光素酶發生反應，生成氧化熒光素 (oxyluciferin)，併產生髮光現象。

對於細菌標記，一般利用發光酶基因操縱子 luxABCDE 或 luxCDABE，其由控制的編碼熒光素酶的基因和編碼熒光素酶底物合成酶的基因組成。利用這種辦法進行標記的細菌會持續發光，不需要外源性底物。但是一般細菌標記需要轉座子的幫助把外源基因插入到細菌染色體內穩定表達。

2. 底物熒光素的特點

熒光素由於諸多優點得到廣大科研人員的青睞，主要特點如下：

① 熒光素不會影響動物的正常生理功能。

② 熒光素是 280 道爾頓的小分子，水溶性和脂溶性都非常好，很容易穿透細胞膜和血腦屏障。

③ 熒光素在體內擴散速度快，可通過腹腔注射或尾部靜脈注射進入動物體內。腹腔注射擴散較慢，持續發光長。熒光素腹腔注射老鼠後約 1min 後表達熒光素酶的細胞開始發光，10min 後強度達到穩定的最高點，在最高點持續約 20~30 min 後開始衰減，約 3h 後熒光素排除，發光全部消失，最佳檢測時間是在注射後 15~35min 之間；若進行熒光素靜脈注射，擴散快，但發光持續時間很短。科研人員根據大量的實驗總結出熒光素的合適的用量是 150mg/kg，即體重 20 克的小鼠需要 3 毫克的熒光素。

④ 觀察時間的間隔沒有最短限制，只要觀察的條件控制一致就可以。雖然底物在動物體內有一定的代謝過程，但是上一次底物的殘留曲線可以知道，可以控制對下一次觀察結果的影響。

3. 光學原理

光在哺乳動物組織內傳播時會被散射和吸收，光子遇到細胞膜和細胞質時會發生折射現象，而且不同型別的細胞和組織吸收光子的特性並不一樣。血紅蛋白（hemoglobin）是造成體內可見光被吸收的主要因素，其吸收可見光中藍綠光波段的大部分。但是在可見光大於 600 奈米的紅光波段，血紅蛋白的吸收作用卻很小。因此，在偏紅光區域, 大量的光可以穿過組織和皮膚而被檢測到。利用活體動物生物發光成像技術最少可以檢測到皮下的幾百個細胞。當然，由於發光源在老鼠體內深度的不同可看到的最少細胞數是不同的。一般認為，每一釐米深度，發光強度衰減 10 倍，血液豐富的組織或器官（比如心臟、肝臟、肺臟）衰減多，與骨骼相鄰的組織或器官衰減少。在相同的深度情況下，檢測到的發光強度和細胞的數量具有非常好的線性關係，可由儀器量化檢測到的光強度，反映出細胞的數量。

二、活體生物發光成像技術應用領域

活體生物發光成像技術是一項在某些領域有不可替代優勢的技術，比如腫瘤轉移研究、藥物開發、基因治療、幹細胞示蹤等方面。

1. 腫瘤學

活體生物發光成像技術能夠讓研究人員能夠直接快速的測量各種癌症模型中腫瘤的生長、轉移以及對藥物的反應。其特點是極高的靈敏度使微小的腫瘤病灶（少到幾百個細胞）也可以被檢測到，比傳統方法的靈敏度大大提高了；非常適合於腫瘤體內生長的定量分析；避免由於宰殺老鼠而造成的組間差異；節省動物成本。由於以上特點，使基於轉移模型、原位模型、自發腫瘤模型等方面的腫瘤學研究得到發展。建立腫瘤轉移模型，可以觀察腫瘤轉移情況，進一步探討腫瘤轉移的機制；可進行原位接種，觀察原位以及原位轉移模型，使腫瘤學研究更接近腫瘤臨床發病的微觀環境；通過建立自發腫瘤模型，可以觀察腫瘤發生機理。

2. 藥物研究

在藥效學評價方面，熒光素酶癌症模型可用於癌症體內用藥在整體動物水平上進行長期療效跟蹤觀察。利用無創傷活體成像對癌細胞生長的檢測，可對癌症治療之前和過程中的癌細胞的變化進行實時觀測和評估。這種方式提供一個很好的對癌細胞的反應和復發評估的預診斷途徑。用活體成像的方法比傳統技術有更高的靈敏度，當用傳統的方法還不能檢測到瘤塊時，用該技術已經可以檢測到很強的訊號。由於該技術只是檢測活細胞，不能檢測已經凋亡的細胞。而用傳統的方法，不能區別正常細胞與凋亡的細胞，所以該技術可以比傳統技術更早更靈敏的發現藥物的療效。

利用活體成像技術高靈敏度、觀察方便的特點，在抗腫瘤藥物臨床前研究中，通過給予腫瘤接種的小鼠不同劑量，不同給藥時間、不同給藥途徑，觀察抗腫瘤藥物的最佳給藥途徑、給藥劑量及給藥時間，從而制定合適的劑型與服藥時間。

在藥物代謝方面，標記與藥物代謝有關的基因，比如 CYP3A4 等，研究不同的藥物對該基因表達的影響，從而可以間接知道相關藥物在體內代謝的情況。

在藥劑學研究方面，可以通過把熒光素酶報告基因的質粒直接裝載在藥物載體中，觀察藥物載體的靶向臟器與體內分佈規律（圖 2）。在藥理學方面，還可以通過轉基因小鼠的應用，觀察藥物作用的通路，用熒光素酶基因標記某一個興趣基因，觀察藥物作用的通路。

一、技術原理

1. 標記原理

哺乳動物生物發光，一般是將 Firefly luciferase 基因（由 554 個氨基酸構成，約 50KD）即熒光素酶基因整合到預期觀察的細胞染色體 DNA 上以表達熒光素酶，培養出能穩定表達熒光素酶的細胞株，當細胞分裂、轉移、分化時, 熒光素酶也會得到持續穩定的表達。基因、細胞和活體動物都可被熒光素酶基因標記。將標記好的細胞接種到實驗動物體內後，當外源（腹腔或靜脈注射）給予其底物熒光素 (luciferin)，即可在幾分鐘內產生髮光現象。這種酶在 ATP，氧存在的條件下，催化熒光素的氧化反應才可以發光，因此只有在活細胞內才會產生髮光現象，並且發光光強度與標記細胞的數目線性相關。

除 Firefly Luciferase 外，有時也會用到 Renilla Luciferase。二者的底物不一樣，前者的底物是熒光素（D-luciferin），後者的底物是 coelentarizine。二者的發光波長不一樣，前者所發的光波長在 540~600nm，後者所發的光波長在 460~540nm 左右。前者所發的光更容易透過組織，後者在體內的代謝比前者快，而且特異性沒有前者好，所以大部分活體實驗使用 Firefly Luciferase 作為報告基因，如果需要雙標記，也可採用後者作為備選方案。

熒光素酶的發光是生物發光，不需要激發光，但需要底物熒光素。熒光素在氧氣、ATP 存在的條件下和熒光素酶發生反應，生成氧化熒光素 (oxyluciferin)，併產生髮光現象。

對於細菌標記，一般利用發光酶基因操縱子 luxABCDE 或 luxCDABE，其由控制的編碼熒光素酶的基因和編碼熒光素酶底物合成酶的基因組成。利用這種辦法進行標記的細菌會持續發光，不需要外源性底物。但是一般細菌標記需要轉座子的幫助把外源基因插入到細菌染色體內穩定表達。

2. 底物熒光素的特點

熒光素由於諸多優點得到廣大科研人員的青睞，主要特點如下：

① 熒光素不會影響動物的正常生理功能。

② 熒光素是 280 道爾頓的小分子，水溶性和脂溶性都非常好，很容易穿透細胞膜和血腦屏障。

③ 熒光素在體內擴散速度快，可通過腹腔注射或尾部靜脈注射進入動物體內。腹腔注射擴散較慢，持續發光長。熒光素腹腔注射老鼠後約 1min 後表達熒光素酶的細胞開始發光，10min 後強度達到穩定的最高點，在最高點持續約 20~30 min 後開始衰減，約 3h 後熒光素排除，發光全部消失，最佳檢測時間是在注射後 15~35min 之間；若進行熒光素靜脈注射，擴散快，但發光持續時間很短。科研人員根據大量的實驗總結出熒光素的合適的用量是 150mg/kg，即體重 20 克的小鼠需要 3 毫克的熒光素。

④ 觀察時間的間隔沒有最短限制，只要觀察的條件控制一致就可以。雖然底物在動物體內有一定的代謝過程，但是上一次底物的殘留曲線可以知道，可以控制對下一次觀察結果的影響。

3. 光學原理

光在哺乳動物組織內傳播時會被散射和吸收，光子遇到細胞膜和細胞質時會發生折射現象，而且不同型別的細胞和組織吸收光子的特性並不一樣。血紅蛋白（hemoglobin）是造成體內可見光被吸收的主要因素，其吸收可見光中藍綠光波段的大部分。但是在可見光大於 600 奈米的紅光波段，血紅蛋白的吸收作用卻很小。因此，在偏紅光區域, 大量的光可以穿過組織和皮膚而被檢測到。利用活體動物生物發光成像技術最少可以檢測到皮下的幾百個細胞。當然，由於發光源在老鼠體內深度的不同可看到的最少細胞數是不同的。一般認為，每一釐米深度，發光強度衰減 10 倍，血液豐富的組織或器官（比如心臟、肝臟、肺臟）衰減多，與骨骼相鄰的組織或器官衰減少。在相同的深度情況下，檢測到的發光強度和細胞的數量具有非常好的線性關係，可由儀器量化檢測到的光強度，反映出細胞的數量。

二、活體生物發光成像技術應用領域

活體生物發光成像技術是一項在某些領域有不可替代優勢的技術，比如腫瘤轉移研究、藥物開發、基因治療、幹細胞示蹤等方面。

1. 腫瘤學

活體生物發光成像技術能夠讓研究人員能夠直接快速的測量各種癌症模型中腫瘤的生長、轉移以及對藥物的反應。其特點是極高的靈敏度使微小的腫瘤病灶（少到幾百個細胞）也可以被檢測到，比傳統方法的靈敏度大大提高了；非常適合於腫瘤體內生長的定量分析；避免由於宰殺老鼠而造成的組間差異；節省動物成本。由於以上特點，使基於轉移模型、原位模型、自發腫瘤模型等方面的腫瘤學研究得到發展。建立腫瘤轉移模型，可以觀察腫瘤轉移情況，進一步探討腫瘤轉移的機制；可進行原位接種，觀察原位以及原位轉移模型，使腫瘤學研究更接近腫瘤臨床發病的微觀環境；通過建立自發腫瘤模型，可以觀察腫瘤發生機理。（圖 1）

2. 藥物研究

在藥效學評價方面，熒光素酶癌症模型可用於癌症體內用藥在整體動物水平上進行長期療效跟蹤觀察。利用無創傷活體成像對癌細胞生長的檢測，可對癌症治療之前和過程中的癌細胞的變化進行實時觀測和評估。這種方式提供一個很好的對癌細胞的反應和復發評估的預診斷途徑。用活體成像的方法比傳統技術有更高的靈敏度，當用傳統的方法還不能檢測到瘤塊時，用該技術已經可以檢測到很強的訊號。由於該技術只是檢測活細胞，不能檢測已經凋亡的細胞。而用傳統的方法，不能區別正常細胞與凋亡的細胞，所以該技術可以比傳統技術更早更靈敏的發現藥物的療效。

利用活體成像技術高靈敏度、觀察方便的特點，在抗腫瘤藥物臨床前研究中，通過給予腫瘤接種的小鼠不同劑量，不同給藥時間、不同給藥途徑，觀察抗腫瘤藥物的最佳給藥途徑、給藥劑量及給藥時間，從而制定合適的劑型與服藥時間。

在藥物代謝方面，標記與藥物代謝有關的基因，比如 CYP3A4 等，研究不同的藥物對該基因表達的影響，從而可以間接知道相關藥物在體內代謝的情況。

在藥劑學研究方面，可以通過把熒光素酶報告基因的質粒直接裝載在藥物載體中，觀察藥物載體的靶向臟器與體內分佈規律（圖 2）。在藥理學方面，還可以通過轉基因小鼠的應用，觀察藥物作用的通路，用熒光素酶基因標記某一個興趣基因，觀察藥物作用的通路。

3. 基因治療

基因治療是將正常基因或有治療作用的基因通過一定方式匯入靶細胞以糾正基因的缺陷或者發揮治療作用，從而達到治療疾病目的。目前，基因治療主要是以病毒做載體，可應用熒光素酶基因作為報告基因加入載體，觀察目的基因是否到達動物體內的特異組織和是否持續高效表達，這種非侵入方式具有低毒性及免疫反應輕微等優點且可以直接實時觀察，瞭解病毒或載體侵染的部位和時域資訊；熒光素酶基因也可以插入脂質體包裹的 DNA 分子中，用來觀察脂質體為載體的 DNA 運輸和基因治療情況；也可以表達熒光素酶基因的質粒裸 DNA 為模型 DNA，直接注入動物體內，利用生物發光成像可以分析不同載體、不同注射位點、不同注射量對熒光素酶基因表達的影響，同時也可以時空量化分析基因表達的分佈、水平和持續時間。這種可視的方法直觀地評價 DNA 的轉染效率和表達效率，在基因治療研究中具有重要的指導作用。

4. 幹細胞及免疫學

用熒光素酶標記幹細胞有以下幾種方法：一種是標記組成性表達的基因，做成轉基因動物，幹細胞就被標記了，若干細胞移植到另外動物體內，可以用活體生物發光成像技術示蹤幹細胞在體內的增殖、分化及遷徙的過程；另外一種方法是用慢病毒直接標記幹細胞後，移植到體內觀測其增殖、分化及遷徙過程，研究其修復、治療損傷或缺陷部分的效果，進一步探討其機制。

可以通過標記免疫細胞，觀察免疫細胞對腫瘤細胞等的識別和殺死功能，評價免疫細胞的免疫特異性、增殖、遷移及功能等；通過標記異體細胞，觀察異體細胞對器官移植影響；也可進行一些關於免疫因子的研究等。

5. 基因表達模式與基因功能研究

研究基因表達可以從影響基因表達的各個不同的層面進行相關的研究，如利用融合蛋白（p27-luc 融合蛋白研究其在 Cdk 細胞分裂週期的表達），興趣基因啟動子控制的熒光素酶（Catenin 在腫瘤轉移的訊號傳導機制），siRNA 方式和轉基因動物等方法。

為研究目的基因是在何時、何種刺激下表達，將熒光素酶基因插入目的基因啟動子的下游，並穩定整合於實驗動物染色體中，形成轉基因動物模型。通過這種方法實現熒光素酶和目的基因的平行表達，從而可以直接觀察目的基因的表達模式，包括數量、時間、部位及影響其表達和功能的因素等；也可用於研究動物發育過程中特定基因的時空表達情況，觀察藥物誘導特定基因表達；以及其它生物學事件引起的相應基因表達或關閉。

6. 蛋白質相互作用

可利用動物體內生物發光成像技術研究活體動物體內蛋白與蛋白的相互作用。其原理是將分開時都不單獨發光的熒光酶的 C 端和 N 端分別連線在兩個不同的蛋白質上，若是這兩個蛋白質之間有相互作用，熒光酶的 C 端和 N 端就會被連線到一起，啟用熒光素酶的轉錄表達，在有底物存在時出現生物發光。在活體條件下研究藥物對蛋白質相互作用的影響，可以觀察到在體外實驗中無法模擬的活體環境對蛋白質相互作用的影響。

7. 細胞凋亡

利用活體動物生物發光成像技術，直接觀察活體動物體內的細胞凋亡。具體原理是用分子生物學方法在熒光酶的兩端連線上抑制其發光的蛋白 (如雌激素)，但在其連線處加上 caspase (細胞凋亡時特異表達的一種酶) 的酶切點。細胞發生凋亡時，表達 caspase，切開抑制熒光酶發光的蛋白，使熒光素酶開始發光。

8. 疾病機理

可以標記與某種疾病密切相關的基因，做成轉基因小鼠，通過特定的藥物作用或其他條件下該基因表達的變化，來推測該疾病的發病機理和藥物對疾病治療的效果等。

9. 其他

如 RNAi、蛋白質核運輸等。在熒光素酶基因的一端接要研究的蛋白質的基因，另一端接肯定在細胞核內表達的蛋白的基因，當核外的蛋白運輸到核內時，就會導致熒光素酶 N 端、C 端靠近，恢復發光。

圖 2 利用 IL-1Β轉基因小鼠篩選抗炎症藥物