【方法篇】基於LC-MS/MS手段分析與MHC結合的肽序列

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肽抗原與主要組織相容性複合體（MHC）編碼的分子結合，並呈現在細胞表面形成T淋巴細胞的靶分子。自適應免疫系統這一關鍵環節可有助於消滅病原體感染細胞和癌症細胞，以及產生相應抗體，那麼對這些抗原肽的鑑定，給新疫苗開發帶來新的契機，新疫苗的目標就是產生有效的適應性免疫。在《Nature Protocols》上科學家發現了一種通過使用LC-MS/MS的方法對這些抗原肽進行分析的方法。

該方法通過對MHC-肽段複合物進行免疫親和捕獲著手，然後提取其中的抗原肽並採用反向高效液相色譜-質譜技術（LC-MS/MS）對其進行分析，從而能鑑定各種細胞上的抗原肽。

T淋巴細胞對外來抗原識別是適應性免疫的基礎，具體來講，胞內抗原在胞漿中降解，抗原前體肽在胞漿中降解轉運到內質網，在這裡它們被進一步修剪成短肽（8-11AA），可以與HLAs class I類分子組裝。這些肽-HLA class I複合物逐漸消退，並被CD8+ T細胞仔細檢查，以尋找與健康細胞環境中不同的外來抗原肽。不同的、致病的或者突變的抗原肽最終會促使細胞感染隨後通過免疫細胞清除。另外外源性抗原也可以被專門的抗原呈遞細胞吸收，並在細胞內小室降解。由此產生的肽（10-20AA）隨後可由II類HLA分析吸收並呈現在細胞表面上。通過抗原特異性CD4+ T細胞識別這些複合物活化T細胞和體液免疫的產生，抗原產生到呈遞到細胞表面傳遞細胞內外通訊的這一免疫過程又可稱為免疫監視，通過T淋巴細胞檢查內源性蛋白表達（CD8+T細胞I型HLA）或者外源性抗原表達（CD8+T細胞I型HLA）。

圖1

不像標準的蛋白質組學方法，通過使用蛋白酶水解後產生的肽段通過液質聯用進行分析，研究HLA結合的肽段具有非常大的難度和挑戰，原因有三個如下所示：

首先，目前肽-HLA複合物的確切水解機制不清楚並且十分複雜，過程中許多蛋白酶和肽酶會參與其中從成熟的複合體中酶解出許多肽段；

其次，與單純胰酶酶解蛋白所產生的肽段相比而言，HLA分子結合的大部分肽段在長度、序列都非常接近。

最後，與之相比，HLA結合的抗原肽丰度都相對較低。

實驗流程

因此，科學家設計了從較複雜組分中分離這些肽段方案，通過採用反向高效液相色譜法（RP-HPLC），其中，根據研究者經驗看，所得到的肽段丰度提高了十倍。此文中圖2中所示一種完整基於HLA結合肽段的分離、鑑定和驗證的實驗流程圖。

圖2

方法的侷限性

直接對HLA結合的肽段進行生化分析，同時能否提供一個對這些肽段真正無偏倚的測量方法，仍然具有侷限性。

覆蓋範圍受到可用於分析的材料數量的限制；僅對小樣本而言，最豐富和最容易檢測到的肽只有數百個，在很多案例中，檢測受到限制都是由於其表位的化學性質：從通常使用的脫鹽介質上的洗脫能力，如C18在預分餾和隨後的液相處理，由於電離能力的限制，可能導致分子的檢測受到損害；採用了一種策略，在MHC I類分子的C端新增一個親和標籤，這樣就可以在研究前進行免疫親和反應。

實驗設計

實驗設計包括選擇感興趣的HLA分子，需要選擇適合的控制實驗的方法；例如，對於感染和腫瘤細胞，需要使用其對應的健康細胞，對於HLA或抗原轉染的抗原呈遞細胞（APCs），則應選擇未轉染的親本細胞系，或不含HLA的細胞系。儘管不全是樣本的限制問題，從資料中得出有意義的結論需要設定三次生物學重複，尤其是比較兩種不同狀態的研究尤為重要；例如，模擬細胞與感染細胞或比較肽的同質異形體。

常規的實驗設計可能包括鑑定來自病原體的HLA複合物並利用功能檢測方法評價其免疫原性。每個實驗室都需要有一個優化好細胞株可進行優化和質量控制（例如，任何一種常見的B淋巴細胞系中表達特定的HLA I 類和II類等位基因的細胞株），此外比較HLA表達量能夠控制實驗中試劑的使用量（例如抗體，和親和的凝膠）。