scRNA_seq:單細胞轉錄組測序簡介

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在傳統的測序技術中，上機測序的樣本是由多個細胞構成的，最後分析得出的結論也只是基於所有細胞的平均水平，但是我們知道細胞是具有異質性的，對於大腦等複雜組織而言，其細胞型別是多樣的；對於腫瘤細胞而言，其細胞異質性更是尤為突出，為了克服細胞異質性的影響，提高科學研究的精度，科學家在不斷嘗試，希望從單個細胞的水平去進行測序分析。

從2009年開始，各種單細胞技術不斷出現，最初由於其通量低，操作繁瑣，價格高等一系列因素，導致其應用並不廣泛，近年來隨著技術的不斷髮展，通量在不斷提升，價格也在不斷下降，單細胞測序技術越來越成熟，出現了很多成熟的平臺，比如本文要介紹的10X  Genomics。

單細胞測序的應用領域非常多，比如CNV檢測，ATAC_seq等, 其中引起廣泛關注的，就是單細胞在轉錄組學的應用，即single cell RNA sequencing, 簡稱scRNA-seq。官方提供的流程如下

10X Genomics公司也為之提供了一系列配套的儀器和軟體，最核心的就是分離細胞，製備文庫的機器，叫做Chromium Controller, 圖片如下

核心是通過構建GEM體系來實現單個細胞的分離，基本結構如下所示，呈現出一個雙十字的結構

首先是Gel Beads，其中包含了幾十萬個bead, 類似探針，用於捕獲細胞中的特定序列，結構如下所示

由4個組成部分，第一段叫做read1, 其實就是adapter序列，用於後續的上機測序，第二段是barcode, 長度為16bp, 用於區分不同的細胞，第三段是UMI,   用於區分不用的轉錄本序列，長度為12bp, 第四段在不同的試劑盒中對應不同的序列，但是作用是相同的，都是用於捕獲目的序列，對於轉錄組測序而言，就是一個30bp的ployT結構，使用者捕獲有ployA尾的轉錄本。

1個Gel在通過第一個通道時，會加入一個細胞和後續反應所需的酶，然後通過第二層通道，第二層通道就是一層油，通過之後，就會形成一個油滴包裹的細胞和酶的混合物，就是一個GEM。

後續的文庫製備示意如下，對於每個單獨的GEM, 其包含的beads用於捕獲該細胞中的轉錄本序列，然後進行反轉錄，PCR擴增等過程

最後通過酶切，末端修飾等過程，構建一個可以用於illumina上機測序的文庫

該文庫的片段構成如下

Read1和Read2就是Truseq的兩個adapter序列，中間的灰色橫線就是實際能夠檢測到的轉錄本序列，對於150bp的讀長而言，這段序列的長度為91bp。

本文重點介紹了10X genomic的單細胞轉錄組文庫的構建過程，後續會進行相關分析的介紹。

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