四種鹼基的判讀-Hiseq測序原理2

本文回答以下兩個問題：
1. 根據掃描得到的光點圖，如何判斷一個位置上的鹼基是什麼
2. 評估1中判斷的可靠性

插圖全部來自【陳巍學基因】視訊2：HiSeq工作原理，本文是對該視訊的學習筆記

1. 四種鹼基的判讀規則

• C > 0.6 即 Ia/Ib > 1.5，該位置的鹼基是“好鹼基”
• Ia ：光點中佔比最高的熒光素含量
• Ib ：光點中佔比第二的熒光素含量
• Pass Filter:前25個鹼基中，壞鹼基的個數小於等於1，則該read的Pass Filter=pass，否則不pass

• 對data進行Pass Filter的目的：去掉多克隆cluster
• 多克隆cluster中光點上，佔比最高的熒光素含量與佔比第二的熒光素含量相近，判讀誤差大，無法確定到底是哪種鹼基
• PF rate = Pass Filter的reads數目/總的測到的reads數目
• 上樣密度過高，PF rate 會下降（多克隆cluster會增多）

2. 評估鹼基判讀

Quality Score

• 評價一個位置上鹼基判讀可靠性的指標，評價鹼基誤判的可能性

  
  
  

• Q30比例 = 達到或超過Q30的資料 / 總的Pass Filter的資料

  
  
  

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