生信基礎知識複習之測序

劉小澤寫於18.11.25

每學習一遍之前的知識，總能從不同角度獲取一些觀點，然後擴增自己的知識庫，這就是“知識迭代”

這次我也就是想到哪寫到哪，把自己認為重要的內容梳理下，用Q&A的形式展示，沒想到測序內容這麼多，所以先當作第一部分吧

測序相關

Q1：生物體內的DNA的ATCG核苷酸是怎麼轉換成計算機識別模式的？

首先要區分

這是ATCG的化學結構，其中A、G結構類似，屬於嘌呤類；C、T（U）結構類似，屬於嘧啶類，我們測序的目的就是區別這幾種結構。人類基因組中有30億個鹼基，要想區分其中的四類鹼基，一個個分析結構肯定不靠譜，於是想到了使用顏色進行區分，也就是“光訊號”方法

Sanger測序、Illumina、454等都是利用光訊號。

光訊號方法就是要讓每個鹼基帶上顏色，就需要給每種鹼基帶上特定的熒光基團，熒光基團在測序儀鐳射作用下被激發，發出的光被照相機記錄下來，然後熒光基團失效，接著加下一個鹼基（利用了illumina的“可逆阻斷終止技術”，簡而言之，就是：在鹼基3‘端加一個阻斷基團，當聚合成功之後，就不能在繼續3‘端加其他鹼基了，這時利用鐳射捕獲熒光訊號，之後切掉熒光基團和阻斷基團，讓下一個帶熒光的鹼基繼續進行）。

另外還可以用“電訊號” （例如英國牛津奈米孔公司ONT的MinION測序儀以及18年被illumina以12億美金收購的太平洋生物公司的SMRT技術）。基本思想就是：4種鹼基結構不同，帶的電荷就不同，在聚合的過程中，讓它們通過電極，產生不同的電訊號，利用電訊號來區分【不過這種測序裝置的靈敏度要求要比光訊號更嚴格，才可以檢測微小的電訊號差別】

然後要規模

早起Sanger測序是利用了“末端終止技術”，這樣準確但是效率比較低，因此illumina開發了“邊合成邊測序”，每合成一次就可以讀取一個鹼基，並且合成越長，測序讀長就越長。這種技術就需要利用PCR進行大規模的擴增，但是我們知道，PCR技術收到酶活性的影響是有合成限制的，不可能無限擴增下去，illumina給出的解決方案就是：“雙末端測序” ，就是正向測一段，反向再測一段，這樣就在PCR迴圈一定的情況下，增加了測序讀長

Q2：測序的基本流程是怎樣的？

以常用的illumina二代測序為例，大體分為：建庫、cluster、測序三步

• 建庫之前：首先進行DNA樣本的質量檢測【1. 最好取單倍體（二倍體或多倍體有等位的雜合位點，測序時不容易分割槽哪種時物種真實存在的雜合位點，哪種時測序錯誤導致的假陽性 ）；2. DNA純度要達到OD值要求（也就是DNA不能混雜蛋白質，對人和動物最好用紅細胞提取DNA ）；3. DNA樣本不能降解（因為測序時需要對樣本進行隨機打斷，一般來講，DNA越長，打斷的隨機性就越高，比如15K序列打斷成500bp文庫，這樣打斷的組合方式就很多，但1K的序列打斷成500bp文庫，組合方式就很少。如果降解成小片段，就無法進行隨機打斷）；4. 測序量要夠，能滿足建庫要求（測序的資料量是由加入的樣本量決定的，並且為了重複需要儲存備份）】

• 建庫： 先理解“文庫”（它是DNA片段的集合，將測序DNA隨機打斷就構成了DNA文庫）。建庫的過程可以想象成是硬碟格式化，出廠的硬碟（也就是未處理的樣本DNA）直接插入計算機（測序儀）是不被識別的，需要分割槽掛載（也就是檢測、打斷、加接頭等操作）後才可以。

  第一步：隨機打斷
  這時的DNA是一條很長的片段（比如幾百K的片段），使用機械法、酶接法、超聲波（常用），然後設定打斷的大小如500bp，然後這個長DNA就會斷成許多的500bp的短片段，就形成了500bp左右的文庫（需要注意：這裡的500bp表示大部分片段在500bp左右，但並非每條片段都正正好好是500bp，可以存在400bp或者700bp）【常見的文庫還有170bp文庫、350bp文庫、800bp、2K、5K、6K等】一般1K以下屬於小片段文庫，1K以上是大片段文庫。文庫大小的值又叫作“插入片段長度 Insert size”（這個值很重要，在序列拼接、短序列比對中會經常用到）

  第二步：電泳
  將一定範圍內的DNA進行回收，如果要500bp文庫，可以回收300-800bp的膠

  第三步：3‘加A
  在3‘加上一個A鹼基，將原來平末端變成粘性末端，更容易在後續過程中連線引物和接頭

  第四步：加index標籤
  這是一個6-8bp的鹼基片段，用於區分不同的測序樣本。現在測序一條lane 能產生30G以上的資料，但是有的物種DNA沒這麼大，為了減少機器空轉，可以將不同物種的DNA混合起來進行測序，但是下機後如何區分提交給客戶呢？這就需要利用標籤

  第五步：加接頭

  加接頭目的是將測序片段固定（或者叫“種”，種花的zhong）在flowcell的lane上，防止被測序的液體沖走。接頭包括：P7接頭、P5接頭，其中P7接頭和lane上的一樣，P5和lane上互補，這樣的目的是為了後面的橋式擴增

• cluster： 這個詞是“簇”的意思，也就是富集序列。因為測序需要熒光訊號，如果僅對一條序列進行檢測，那麼訊號很弱，識別錯誤率會很高，如果對一簇相同的序列同時檢測某個位點的光訊號，那麼準確度就大大提高
  這個過程就是“橋式PCR”，原來一條鏈以指數增長成為一簇“克隆”
  序列條數x測序讀長=一次測序量

• 測序：加入dNTP（與橋式PCR中加的普通dNTP不同，它的3‘被疊氮基團修飾）、聚合酶。先從cluster同一條鏈的第一個鹼基開始測，再到第n個鹼基，直到測完整條鏈，得到reads1【注意這裡才正式出現了reads這個名詞，意思就是：一個鹼基一個鹼基讀取】
  測完reads1，加入鹼性溶液將剛才測序完的鏈解鏈沖掉，加再入第二種測序引物，正好reads2的測序引物結合位點在index序列旁，先讀取6-8個鹼基測得index序列；
  然後合成原來測序鏈的互補鏈，並切除原來測序鏈，還是按照原來方法測的reads2

測序完成後並沒有得到想要的ATGC鹼基順序，而是一堆照片，下面就是影象處理轉換成有顏色的光點檔案（二進位制BCL檔案，即basecalling），其中包括測序儀編號、run序號、lane序號、tile號、X/Y座標、index、reads1/2、鹼基序列、質量序列、是否通過質量過濾（1為通過；0表示質量差）

Q3：已經知道文庫有大片段文庫（1K以上）和小片段文庫，文庫多大就能測多大嗎？另外測序是雙端測150bp左右，那麼中間還有一部分沒有測到，這樣會不會有問題？基因組上的這部分割槽域會被忽略嗎？

首先，不管構建多大的文庫，測序得到的都是兩端很短的序列（比如雙端150就是得到兩個150bp的reads）；

其次中間測不通並不會有問題，而且是非常正常的現象！因為文庫構建是隨機打斷過程，所以即使第一條片段中間沒有被測到也沒關係，後面的其他片段一定能測到這中間的部分（因為一次測序過程會產生成百上千萬條reads，而基因組就那麼大）

另外，你可能會想：既然只能測兩端很短的一部分，那麼小片段和大片段文庫的區別在哪？反正都測不完。其實，大片段文庫的目的，除了得到序列以外，更重要的是，為了獲取片段的座標距離（即兩條reads之間的物理距離關係，將會為序列拼接和基因組結構變異檢測提供幫助） 。當然，目前大片段文庫還有一些問題，比如現在PCR手段不能擴增太長的片段，另外我們只能測兩側的很短的片段，那麼中間合成出來卻不能測，造成了浪費！

但是這些問題illumina給出了大片段文庫的解決辦法：

在隨機打斷序列後，大片段比小片段文庫多了一個環化處理，經過末端修復，再將一個線性長片段頭部進行生物素標記，再進行環化（即：把片段首尾連線成一個環）【我們現在知道了：小片段文庫是pair end； 大片段文庫是mate pair】
曾經我也是為這兩個概念搞的頭暈轉向?

關於大小片段文庫的差別：

Q4：為什麼不能測完整的基因組？

理想的情況是：基因組有多大，我們就能測多大

但事實是：我們提取的DNA就不是完整的一整條，而是斷成許多片段，比如10M基因組提取出來，可能也就剩一堆幾百K的片段。現在可以做的就是對這些幾百K的片段隨機打斷測序；另外，目前二代測序基本都依賴PCR擴增，因此限制了讀長

Q5: 目前市面上一二三代測序並存，怎麼選擇？

存在即合理，因為沒有任何一種測序技術能勝任任何工作，才會出現現在的局面。對於選擇困難症患者來講，一般可以從測序讀長、通量、準確性、價格角度考慮

所以也能理解，為什麼illumina是目前的龍頭，另外收購Pacbio後它在三代的市場又可以一展拳腳了

Q6: GC bias是什麼意思？

基因組正常的GC含量是35-65%，如果小於35%或者大於65%就屬於異常。我們知道AT是2個氫鍵連線，而GC是3個氫鍵，因此如果GC含量太高，在PCR過程中解鏈需要的能量更高，導致模版鏈更難開啟，預設的溫度下，DNA模版變性不完全；另外PCR產物難易結合到模版，DNA聚合酶也難以延伸，結果就是出現非特異性條帶，不容易被擴增，因此也無從談及測序，最後基因組覆蓋不均勻，丟失部分資訊

對於這樣的樣品，可以構建PCR-free文庫 ，但需要更多樣本量

Q7: 關於讀長、插入片段大小的選擇

我們知道了小片段測序文庫中有多種規格可供選擇，如：170bp、350bp、500bp、700bp等。讀長的話，在保證準確性前提下，越長越好，有利於序列拼接。例如Miseq可以實現PE 300bp的讀長，如果選擇500bp文庫和Miseq PE300（效果可以和454差不多了），那麼中間就會有100bp重疊區域，發生了所謂的“片段測通”，可以利用這個區域將兩個reads拼接起來，形成更長的序列。

文庫大小需要和reads讀長相協調，對於較短的測序片段，文庫不能過大；對於De novo 拼接，可以先使用小片段文庫，然後轉為大片段文庫，並逐級增加文庫大小如2K、6K、10K、20K等【目的就是合理使用重疊區域進行逐級拼接】

Q8：為什麼小片段文庫如500bp需要兩端分別測，而不能一次測通500bp呢？

利用PCR反應是可以實現的，就是一直擴增，把500bp全部測出來。不能這麼做的一個因素是：PCR中DNA聚合酶的活性會下降，因此測序錯誤率會隨著測序長度增加而增加 ；另外一個因素就是Phasing，按說cluster中所有片段都要保持同步，第一次大家都加第一個鹼基，第二次都加第二個鹼基… 但實際上，總有幾個走的快或者走的慢（一次加兩個鹼基或者這一次一個鹼基也沒加），這些“離群”的鹼基出來的熒光值就會帶給整體干擾

Q9：不同的測序，不同的操作？

對於全基因組測序，就是按上面的測序步驟就好；

對於轉錄組測序，就需要考慮RNA反轉錄的問題，那麼是先反轉錄再打斷還是先打斷後反轉錄呢？ 其實比較高效的方法是：先反轉錄後打斷。一般轉錄本比較短（小於2K），那麼選擇文庫時就不能太大（比如，不能選800bp文庫，因為2K的序列，打斷成800，隨機性不是很好），可以考慮小一些的文庫（300左右）

另外還有很多測序型別：外顯子組、甲基化、小RNA、巨集基因組等

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